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Retos en alto Cytometry de flujo de la complejidad

Thought LeadersMª José MarcoDepartment of HematologyHospital Dr. Peset

La década pasada ha considerado una revolución en inmunoterapia del cáncer.  La demanda de doctores, de investigadores, y de compañías farmacéuticas para resultados más exactos con la alta prueba del sensibilidad y de alta calidad está aumentando inmenso.

En esta entrevista, Dracmas. Mª José Marco del departamento de la hematología en el Dr. Peset de Hopsital habla con las ciencias de la vida Noticia-Médicas sobre alto cytometry de flujo de la complejidad y los retos que hacen frente a menudo.  

Dé por favor una reseña del alto cytometry de flujo de la complejidad. ¿Qué contribuye a su complejidad comparada al cytometry de flujo inferior de la complejidad?

Mucha gente confunde el alto cytometry de flujo de la complejidad del término (HCFC) con el aumento simple en el número de parámetros que poder medir en un cytometer. Para mí, este concepto es algo mucho más complejo. Cuando referimos a HCFC, no sólo estamos hablando del número de colores, pero también de la calidad, de la automatización, de las herramientas de análisis, de los reactivos, y del estado mayor.

La ejecución de HCFC significa perfeccionar en cada uno de estos aspectos para obtener resultados más completos, más exactos, y más de alta calidad; y, en mi caso, esto afecta directamente a la calidad de vida de mis pacientes.

¿Por qué se utiliza el alto cytometry de flujo de la complejidad? ¿Qué usos hay para esta técnica?

En la década pasada, hemos experimentado una revolución en inmunoterapia del cáncer. Los avances importantes se han observado no sólo en el alcance directo de los antígenos superficiales del tumor vía los nuevos anticuerpos monoclonales, como Daratumumab o el linfocito T Engagers (mordeduras) de Bispecific como Blinatumomab, pero también en el área de la terapia celular adoptiva (ACT) con el revelado de las células de T quiméricas del receptor del antígeno (células de T del VEHÍCULO) o la identificación de las moléculas que vencen la supresión inmune inhibitoria creada por las células del tumor.

Immunophenotyping por cytometry de flujo desempeña una central y un papel muy relevante en muchas de estas terapias. Es decir el cytometry de flujo no sólo se utiliza para la diagnosis y la clasificación del linfoma y de la leucemia, pero también para la detección de la enfermedad residual mínima (MRD) después del tratamiento, para estudiar la inmunorespuesta de pacientes, e incluso para el mando de progreso del tratamiento sí mismo, tal como vigilar el número de células del CARRO que siga habiendo activas en el paciente después de la infusión.

Debido a todas estas razones, doctores y resultados más exactos farmacéuticos de la demanda de compañías de la alta sensibilidad y de una prueba más de alta calidad.  Él isnecessary llevar a cabo mejoras en cada aspecto de HCFC.

Haber de imagen: Shutterstock/luz cristalina

(MRD)¿Cuál es detección residual mínima de la enfermedad, y cómo se pueden cytometry de flujo utilizar en su detección?

La enfermedad residual (mensurable) mínima (MRD) refiere al pequeño número de células cancerosas que siga habiendo en la carrocería después del tratamiento. Las mediciones diagnósticas tradicionales, tales como immunohistochemistry y morfología, tienen sensibilidades de la detección de solamente 10-2 - 10-3, que no predicen seguro supervivencia progresión-libre (PFS) o supervivencia total (OS) después de estos tratamientos.

La capacidad de determinar las células patológicas puede ofrecer la información valiosa en la reacción y el riesgo clínicos de recaída. La negatividad del milirutherford se asocia constantemente a supervivencia progresión-libre y total perfeccionada. Si estuvo validado apropiadamente y estandardizado, podría ser utilizada como biomarker sustituto de la punto final en las juicios clínicas que evaluaban terapias nuevas. Entonces, hay un interés clínico cada vez mayor en la medición y el logro de la negatividad del milirutherford en varias enfermedades hematológicas, por ejemplo en mieloma múltiple, donde están convertidos actualmente los procedimientos del milirutherford.

La supervisión del milirutherford del mieloma múltiple se hace actualmente con las plataformas sensibles tales como reacción en cadena alelo-específica cuantitativa de polimerasa del oligonucleótido (ASO-qPCR), siguiente-generación que ordena (NGS), y cytometry de flujo multiparametric (MFC). ASO-qPCR y NGS tienen sensibilidades excelentes de la detección (10-5 - 10)-6, pero estas tecnologías tiene aplicabilidad más inferior cuando está comparado al MFC.

El MFC convencional puede alcanzar fácilmente una sensibilidad de la detección de 10-4, pero lograr la alta sensibilidad requerida para la evaluación del milirutherford, millones de células tienen que ser detectados y los protocolos immunophenotyping convencionales no pueden lograr estos números. Las pautas actuales del consenso requieren una condición atmosférica mínima de 2 millones y recomiendan 5 millones de acciones se detecten para alcanzar una sensibilidad mínima de 10.-5

Es decir hemos tenido que aumentar la especificidad y la sensibilidad de la técnica para detectar un mayor número de acciones y para distinguir normal de las células de plasma anormales.

¿Qué retos hay a adoptar alto cytometry de flujo de la complejidad?

En mi opinión, esos retos se pueden incluir en tres escenarios importantes. Debemos centrarnos en la mejoría de la coloración, de la adquisición, y de procesos analíticos. Por supuesto, en todos los niveles, los elementos de la calidad acreditada deben ser introducidos, que en mi caso deben ser válidos para la diagnosis clínica.

Si nos centramos en procedimientos de muestra-coloración, qué primero pensamos alrededor está introduciendo procesos de la automatización para reducir el manchar de épocas y para eliminar desvío humano. Los paneles de Immunophenotyping se están convirtiendo complicaron más en la adopción de HCFC, y éste afecta directamente al tiempo que un técnico pasa en el manejo del reactivo.

La mejoría de los procesos de adquisición, quizás, se conecta más directamente al revelado de los cytometers de alto rendimiento del flujo a muchos parámetros para la adquisición de paneles complejos. Deben también tener una alta capacidad para la informática, y, facilitar control de calidad, deben hacerlo fácil vigilar funcionamiento, la calibración, y procesos de la remuneración y de la estandarización entre los cytometers.

Finalmente, necesitamos el estado mayor calificado, así como el software de análisis que permite que realicemos estrategias de análisis complejas, y que puede tramitar un gran número de acciones y de parámetros.

¿Cómo se pueden los fotodiodos del alud (APDs) utilizar en lugar de los tubos de fotomultiplicador (PMTs) para ayudar a simplificar la tecnología usada?

He tenido experiencia extensa usando los cytometers de CytoFLEX en el laboratorio para los proyectos de investigación del intra-laboratorio en oncología, neumología, y nefrología. Este cytometer incluye APDs (fotodiodos del alud) en vez de PMTs (tubos de fotomultiplicador) como detector del fotón. Mi reacción sobre APDs es positiva.

Primero, ha mostrado grandes linearidades entre las intensidades medidas (MFI) y las fijaciones del avance del detector. Desde un punto de vista práctico, el software puede recalcular automáticamente valores del despilfarro en tiempo real mientras que se ajustan los avances. Esto ha permitido que utilice el mismo experimento de la remuneración en paneles con diversas fijaciones del avance. Así pues, no hay tiempo extra necesario hacer una calibración de la remuneración en comparación con cytometers tradicionales del flujo usando detectores de PMT.

Otra característica notable es su sensibilidad de la fluorescencia y ruido electrónico inferior. La sensibilidad es la capacidad de medir inferior-intensidad señal-en otras palabras, para considerar las poblaciones oscuros y brillantes en la misma muestra. Al detectar números elevados de las acciones para el milirutherford estudia, sensibilidad es crucial porque las configuraciones de la expresión del antígeno de poblaciones normales abundantes pueden recubrir con las configuraciones de la expresión de las poblaciones anormales raras de la célula.

Así pues, conseguir la discriminación más sin obstrucción entre las células normales y anormales, recomiendo el alto cytometry de flujo de la complejidad (HCFC), donde se adoptan las técnicas de coloración innovadoras y cytometer del flujo de la tecnología de APD.

Haber de imagen: Fotos de Shutterstock/CI

¿Cómo pueden el software y la remuneración a los parámetros determinados de la prueba ayudar a investigadores con alto cytometry de flujo de la complejidad?

Me convencen de que, para la mayoría de los utilizadores del cytometry de flujo, cualquier herramienta que facilite remuneración automática a través del software intuitivo y fácil de usar es esencial hoy. Esto es especialmente verdad al realizar alto cytometry de flujo de la complejidad estudia, que requieren un mayor número de paneles multicolores, donde la combinación de toda la fluorescencia genera una matriz grande de la remuneración.

En nuestra evaluación de DxFLEX, realizamos que compensando 13 colores es muy fácil (trabajamos generalmente con en medio 8 a 10 colores). Es solamente necesario manchar los tubos individuales para que cada fluorescencia sea estudiada, detectarlos usando el módulo automático de la remuneración, y fijar el software para calcular la matriz de la remuneración. Esta matriz de la remuneración se puede salvar en una biblioteca de la remuneración que se pueda utilizar conjuntamente con las fijaciones del avance del catálogo para crear cualquier combinación de fijaciones en un panel.

Estas características salvan mucho tiempo en la creación de experimentos, y en el funcionamiento de la supervisión de los cytometers, además de facilitar flujos de trabajo.

¿Cómo los reactivos de CE-IVD se utilizan en alto cytometry de flujo de la complejidad? ¿Por qué es importante utilizar éstos, y qué retos extras traen?

Hoy, estamos bajo presión cada vez mayor de la administración del gobierno y de las instituciones de salud para cumplir con una serie de reglas y de acreditaciones del control de calidad del laboratorio para asegurar la calidad y la confiabilidad de resultados. Dentro de este contexto, y bajo premisas incluso de ofertas públicas, la marca de CE-IVD es cada vez más necesaria para el equipo, pero también para los reactivos. Uno de nuestros retos más grandes, por lo tanto, es aumentar el número de reactivos con esta aptitud, puesto que, además de facilitar la acreditación, disminuyen la validación interna y dan resultados seguros para evitar la repetición de pruebas.

Por ejemplo, CE-IVD-etiqueta los anticuerpos asegure los productos de calidad, el alto rendimiento de fluorocromos en tándem, y estado coherente del lote-a-lote, las características importantísimas en HCFC experimenta. Encontrar el fabricante con el catálogo más grande de estos productos diferenciará.

¿Qué se puede hacer con la preparación de la muestra para simplificar alto cytometry de flujo de la complejidad?

Para simplificar la preparación de las altas muestras de la complejidad, usted puede elegir automatizar el proceso o los tubos predesigned uso con un cóctel de anticuerpos puestos en unidades.

En nuestro laboratorio, tenemos experiencia extensa con los tubos de DURAClone de la cuchilla de Beckman en proyectos de investigación. Estos tubos contienen una combinación de los anticuerpos monoclonales pre dispensados y secados en la parte inferior del tubo. Usando ellos requiere menos tiempo con manos y disminuye medir con una pipeta desvíos. Estas características nos han permitido perfeccionar importante nuestros flujos de trabajo del laboratorio y costos más bajos debido a una reducción en desvíos.

Haber de imagen: Shutterstock/Kateryna Kon

¿Qué el Cytometry de flujo de la cuchilla de Beckman ofrece ayudar a retos vencidos en alto cytometry de flujo de la complejidad?

Una de mis preocupaciones más grandes de la rutina diaria de nuestro laboratorio era la necesidad de detectar un número suficientemente grande de acciones para lograr una sensibilidad de 10-6 en el estudio del milirutherford para el mieloma múltiple.  Con DxFLEX hemos logrado esto, pues hemos podido detectar hasta 25 millones de acciones por la adquisición.

Además, hemos podido probar su configuración máxima con 13 paneles del color que ofrecen mayores especificidad y complejidad al análisis, mientras que reduce el número de tubos por panel del estudio.

Por otra parte, también hemos perfeccionado flujos de trabajo en la muestra que tramitaba optimizando nuestro LDTs (pruebas desarrolladas laboratorio) que adoptaban la tecnología de DURAClone, y en el proceso de adquisición con la remuneración automática, la estandarización, control de calidad diario, y vigilando los módulos del funcionamiento incluidos en el software de DxFLEX.

Cuando primero hice un utilizador del cytometry de flujo trabajé con otra compañía comercial. Cuando comencé a trabajar con ciencias de la vida de la cuchilla de Beckman, la calidad del apoyo humano y científico detrás de sus productos, incluyendo la formación del personal y una buena voluntad me sorprendí agradable su conocimiento tecnológico, y también de ayudarnos a ejecutar nuevas técnicas.

¿Cuál es el futuro del alto cytometry de flujo de la complejidad?

Creo que la evolución natural de HCFC continuará requerir las nuevas herramientas perfeccionar la coloración, adquisición, y los procesos analíticos. De esta manera, me plazco ver que las ciencias de la vida de la cuchilla de Beckman están desarrollando los productos tales como los cuales ofrezca las soluciones para cada uno de estos puntos, por ejemplo, tecnología de DURAClone para perfeccionar la coloración de procesos, y del equipo avanzado tal como DxFLEX para perfeccionar procesos de adquisición.

Sin embargo, pienso que uno de los retos más grandes será al tramitar datos, pues pronto seremos más capaces de aumentar el número de muestras tramitadas y el número de parámetros analizados. Esto nos moverá gradualmente hacia el análisis unicelular alto-dimensional, que presenta sus propios retos en términos de gestión de datos, visualizaciones de los datos, reproductibilidad del resultado, potencia de cómputo, y distribución de información.

En este sentido, tengo granes expectativas de la cuchilla de Beckman como resultado de su adquisición del software de Cytobank, que habilita la nube que calcula para el análisis del cytometry de flujo. El revelado en curso por las personas del software de Cytobank y de Kaluza es prometedor, y espero incluir estas nuevas herramientas en la investigación futura.

¿Dónde pueden los programas de lectura encontrar más información?

Para descubrir satisfaga más para visitar:

  • Consideraciones internacionales del consenso del grupo de trabajo del mieloma para la reacción y la evaluación residual mínima de la enfermedad en mieloma múltiple. Kumar S, Paiva B, Anderson kc, Durie B, Landgren O, Moreau P, y otros lanceta Oncol. (2016) 17: e328-46. doi: 10.1016/S1470- 2045(16) 30206-6
  • Pautas del consenso en análisis residual mínimo y la información de la enfermedad del mieloma de la célula de plasma. Arroz M, vino N, Lin P, Chen W, Yuan C, Lagoo A, y otros Cytometry B Clin Cytom. (2016) 90:31 -. doi 9: 10.1002/cyto.b.21228
  • Flujo de la generación siguiente para la detección altamente sensible y estandardizada de la enfermedad residual mínima en mieloma múltiple. Flores-Montero J, Sanoja-Flores L, Paiva B, Puig N, García-Sánchez O, leucemia 2017 de Böttcher S y otros oct; 31(10): 2094-2103. doi: 10.1038/leu.2017.29
  • Enfermedad residual mensurable por cytometry de flujo de la Siguiente-Generación en mieloma múltiple. Paiva B, Puig N, TA de Cedena, Rosiñol L, Cordón L, MB de Vidriales, y otros J 2020 Clin Oncol. 10 de marzo; 38(8): 784-792. doi: 10.1200/JCO.19.01231
  • Pautas prácticas para la optimización y la caracterización de la plataforma de CytoFlex TM de la cuchilla de Beckman. Bhowmick D, Sheridan RTC, Bushnell TP, Spalding kilolitro. Doi 2020 de la pieza A. del Cytometry: 10.1002/cyto.a.23998
  • Un cytometer Semiconductor-Basado novela del flujo con la sensibilidad aumentada de la dispersión de la Luz para el análisis de nanoparticles biológicos. CROMATOGRAFÍA GASEOSA de Brittain, Chen YQ, Nartinez E, espiga VA, Tylre M R, Langlois mA, Gulnik. Sci representante 2019 5 de noviembre; 9(1): . doi 16039: 10.1038/s41598-019-52366-4
  • https://www.mybeckman.uk/flow-cytometry/instruments/dxflex?country=GB

Alrededor Mª José Marco

Dracmas. Mª José Marco es hematólogo en el departamento de la hematología, el Dr. Peset del hospital, en Valencia, España. Después de terminar su grado médico en la universidad de Valencia, España, ella ganó experiencia extensa en la diagnosis del cytometry de flujo que implicaba immunophenotyping de la leucemia y del linfoma.

En el laboratorio especializado de la hematología, ella ha tenido siempre responsabilidad de la atención sanitaria en cytometry de flujo, y ella ha sido un autor de introducir las adaptaciones tecnológicas que son posibles y necesarias perfeccionar atención a los pacientes. Su investigación se ha centrado en clínico-biológico, los aspectos residuales diagnósticos y mínimos de la enfermedad con alto cytometry-principal del flujo de la complejidad en monoclonal gammopathies-y ella ayudan con diseño y el revelado de juicios clínicas del estado inmune en pacientes con los trasplantes del cáncer y de órgano.

Citations

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    Beckman Coulter Life Sciences - Flow Cytometry. (2020, September 25). Retos en alto Cytometry de flujo de la complejidad. News-Medical. Retrieved on November 26, 2020 from https://www.news-medical.net/news/20200924/Challenges-in-High-Complexity-Flow-Cytometry.aspx.

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    Beckman Coulter Life Sciences - Flow Cytometry. "Retos en alto Cytometry de flujo de la complejidad". News-Medical. https://www.news-medical.net/news/20200924/Challenges-in-High-Complexity-Flow-Cytometry.aspx. (accessed November 26, 2020).

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    Beckman Coulter Life Sciences - Flow Cytometry. 2020. Retos en alto Cytometry de flujo de la complejidad. News-Medical, viewed 26 November 2020, https://www.news-medical.net/news/20200924/Challenges-in-High-Complexity-Flow-Cytometry.aspx.