Avertissement : Cette page est une traduction automatique de cette page à l'origine en anglais. Veuillez noter puisque les traductions sont générées par des machines, pas tous les traduction sera parfaite. Ce site Web et ses pages Web sont destinés à être lus en anglais. Toute traduction de ce site et de ses pages Web peut être imprécis et inexacte, en tout ou en partie. Cette traduction est fournie dans une pratique.

Méthode exempte de bactéries pour effectuer à SARS-CoV-2 les clones infectieux

Utilisant une amplification en chaîne par polymérase circulaire, les chercheurs ont développé une méthode pour effectuer le virus recombiné du coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de syndrôme respiratoire aigu sévère, avec la capacité d'introduire des mutations. La recherche par les scientifiques japonais est publiée sur le bioRxiv* de serveur de prétirage en septembre 2020.

Car la pandémie COVID-19 continue à infecter les gens de plus en plus, il y a un grand besoin de comprendre les mécanismes par lesquels le virus SARS-CoV-2 entraîne la maladie COVID-19, l'infecte, et la reproduit en cellules hôte. Pour comprendre mieux comment la maladie se développe, il est nécessaire d'avoir un système inverse simple de génétique pour le virus.

De tels systèmes sont habituellement effectués utilisant les clones infectieux ayant l'ADNc viral entier. Cependant, l'ADNc pour des coronaviruses ne sont pas tout procurables que les génomes viraux sont grands. Au lieu de cela, des chromosomes artificiels bactériens (BAC) ou les éclats de l'ADNc sont joints ensemble in vitro.

Mais, ces systèmes ont leurs désavantages. Dans des systèmes de BAC, il peut y avoir des mutations non désirées provoquées par l'amplification bactérienne, qui exige alors vérifier le génome entier chaque fois, un procédé long. La jointure ensemble des éclats d'ADNc est un procédé compliqué exigeant des compétences.

Une autre méthode emploie l'amplification en chaîne par polymérase circulaire (CPER), de produire des clones infectieux des flaviviruses. des éclats d'ADNc et un éclat de lieur sont amplifiés par amplification en chaîne par polymérase (PCR). Les éclats amplifiés sont conçus pour comprendre les extrémités superposantes avec d'autres éclats, et par conséquent peuvent être étendus comme génome viral circulaire. Ce génome viral est alors introduit dans les cellules appropriées, et des clones viraux infectieux sont récupérés.

Établissement de génétique inverse basée sur CPER pour SARS-CoV-2. (a) Représentation schématique d
Établissement de génétique inverse basée sur CPER pour SARS-CoV-2. (a) Représentation schématique d'une approche de CPER pour le rétablissement de SARS-CoV-2 recombiné. Un total de 9 éclats (F1to F8, et F9/10) couvrant l'intégral du génome SARS-CoV-2 ont été amplifiés, puis assemblés avec un éclat de lieur de RNT comprenant le HDVr, le signe de polyA de BGH et le promoteur de CMV par CPER. Les produits donnants droit de CPER étaient transfecté dans les cellules susceptibles. (b) Les cellules HEK293-3P6C33 étaient transfecté avec le produit de CPER et l'image lumineuse d'inducteur a été acquise à la goujon-transfection de 7 jours (dpt) (est parti). Comme contrôle négatif, le produit de CPER obtenu sans éclat F9/10 était transfecté dans des cellules et l'image lumineuse d'inducteur a été obtenue à la DPT 7 (droite). (c) Marqueurs génétiques (2 mutations, A7,486T et T7,489A silencieux) dans le génome SARS-CoV-2 recombiné. (d) Comparaison de la cinétique d'accroissement du SARS-CoV-2 recombiné produit par CPER avec cela de l'isolat originel. Les cellules VeroE6/TMPRSS2 étaient infectées avec les virus (MOI=0.001 ou 0,01), et des titres infectieux dans les supernatants de culture des cellules de SARS-CoV-2-infected ont été déterminés par l'analyse TCID50 à partir de 12 à 48 heures de goujon-infection (hpi). (e) Analyses du nord de tache de RNAs subgenomic. RNAs a extrait des cellules infectées avec le virus parental et les SARS-CoV-2 recombinés récupérés par CPER ont été soumis aux analyses du nord de tache.

CPER pour SARS-CoV-2

Dans une étude neuve, une équipe de recherche avait l'habitude l'approche de CPER pour produire des clones infectieux pour SARS-CoV-2.

D'abord, pour vérifier si l'approche de CPER pourrait être employée pour SARS-CoV-2, les chercheurs avaient l'habitude 10 éclats viraux de gène, qui ont couvert le génome viral entier, un éclat de lieur, avec un promoteur pour copier dans un plasmide. Puis, ils ont employé 10 éclats d'ADNc des éclats viraux de gène, branchés les 9th et 10th éclats par ACP, et CPER exécuté, quand l'ADNc intégral était clone obtenu.

Pour vérifier si les produits obtenus étaient viables, ils les cellules infectées avec ces produits et ont étudié les cellules pour des modifications à cause du viral infection. Ils ont trouvé les gènes viraux recombinés formés après 7 jours de transfection dans les cellules, mais seulement dans un type de cellules, HEK293-3P6C33. Ceci propose que le rendement de transfection des produits de CPER et le rendement de réplication du virus soient importants pour former un virus recombiné.

Les auteurs ont exécuté l'ordonnancement génétique des virus constitués par la méthode de CPER, qui a montré qu'il n'y avait aucune contamination du virus, et il a mis à jour les repères génétiques. Ils ont trouvé seulement une différence dans les repères génétiques du virus P0, montrant que le système inverse de génétique pour le SARS-CoV-2 a eu de grande précision.

Après contrôle de plusieurs jeux d'amorce, les auteurs ont trouvé que le modèle des amorces est important pour l'ensemble efficace du génome circulaire. Par conséquent, la « enquête postérieure des conditions de CPER (c.-à-d., des séquences de promoteur et des jeux d'amorce) pour SARS-CoV-2 peut améliorer la guérison des recombinants, » écrivent les auteurs.

Les chercheurs ont également vérifié la cinétique du virus recombiné comparé au virus du parent SARS-CoV-2. Ils ont constaté que le bouturage du virus recombiné était plus lent que celui du virus de parent, mais ont atteint les niveaux assimilés à celui du virus de parent.

L'analyse du nord de tache a montré à huit RNAs subgenomic, dans le virus recombiné et le virus de parent. Ainsi, les caractéristiques biologiques du virus constitué par la méthode de CPER sont assimilées à celle du virus de parent.

Ajouter des mutations

Les chercheurs ont vérifié la méthode de CPER pour ajouter des gènes de journaliste au virus recombiné. Ils ont remplacé une séquence des nucléotides dans le génome viral par le gène de sfGFP.

Sur l'analyse de séquences après CPER et la fluorescence de contrôle de GFP après l'expression de la protéine fluorescente en cellules, elles ont trouvé que le virus recombiné a eu la mutation ajoutée. Cependant, le taux de croissance du virus muté était plus lent que celui du parent.

Cependant, quand les chercheurs ont employé NanoBiT, un journaliste de fractionnement ayant deux sous-unités, haut-affinité NanoBiT (HiBiT) et grand NanoBiT (LgBiT), la cinétique d'accroissement était assimilée à celle du virus de type sauvage.

Dans leur test, ils ont inséré le gène de luciferase de HiBiT et une séquence de lieur dans le virus SARS-CoV-2 par ACP et ont puis employé CPER pour produire de SARS-CoV-2 recombiné avec HiBiT. Les études précédentes ont montré que le gène de HiBiT peut être utile pour les expériences et le dépistage des drogues sur des animaux.

En outre, les auteurs ont également montré qu'ils pourraient insérer une mutation dans la protéine de pointe du virus, qui a été vu en à l'Europe et aux Amériques, sans n'importe quel changement de la cinétique d'accroissement du virus recombiné.

Ainsi, les auteurs disent que la méthode de CPER peut être un outil rapide et droit pour développer les vaccins sous tension-atténués par coffre-fort et caractériser des mutations dans le virus lors d'employer des vaccins ou des médicaments.

Avis *Important

le bioRxiv publie les états scientifiques préliminaires qui pair-ne sont pas observés et ne devraient pas, en conséquence, être considérés comme concluants, guident la pratique clinique/comportement relatif à la santé, ou traité en tant qu'information déterminée.

Journal reference:
Lakshmi Supriya

Written by

Lakshmi Supriya

Lakshmi Supriya got her BSc in Industrial Chemistry from IIT Kharagpur (India) and a Ph.D. in Polymer Science and Engineering from Virginia Tech (USA).

Citations

Please use one of the following formats to cite this article in your essay, paper or report:

  • APA

    Supriya, Lakshmi. (2020, September 27). Méthode exempte de bactéries pour effectuer à SARS-CoV-2 les clones infectieux. News-Medical. Retrieved on December 01, 2020 from https://www.news-medical.net/news/20200927/Bacteria-free-method-for-making-SARS-CoV-2-infectious-clones.aspx.

  • MLA

    Supriya, Lakshmi. "Méthode exempte de bactéries pour effectuer à SARS-CoV-2 les clones infectieux". News-Medical. 01 December 2020. <https://www.news-medical.net/news/20200927/Bacteria-free-method-for-making-SARS-CoV-2-infectious-clones.aspx>.

  • Chicago

    Supriya, Lakshmi. "Méthode exempte de bactéries pour effectuer à SARS-CoV-2 les clones infectieux". News-Medical. https://www.news-medical.net/news/20200927/Bacteria-free-method-for-making-SARS-CoV-2-infectious-clones.aspx. (accessed December 01, 2020).

  • Harvard

    Supriya, Lakshmi. 2020. Méthode exempte de bactéries pour effectuer à SARS-CoV-2 les clones infectieux. News-Medical, viewed 01 December 2020, https://www.news-medical.net/news/20200927/Bacteria-free-method-for-making-SARS-CoV-2-infectious-clones.aspx.