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Metodo esente da batteri per rendere a SARS-CoV-2 i cloni contagiosi

Facendo uso di una reazione a catena circolare della polimerasi, i ricercatori hanno messo a punto un metodo per la fabbricazione del virus recombinante di coronavirus 2 (SARS-CoV-2) di sindrome respiratorio acuto severo, con la capacità di introdurre le mutazioni. La ricerca dagli scienziati giapponesi è pubblicata sul bioRxiv* del " server " della pubblicazione preliminare nel settembre 2020.

Poichè la pandemia COVID-19 continua ad infettare sempre più la gente, c'è una grande necessità di capire i meccanismi da cui il virus SARS-CoV-2 causa la malattia COVID-19, infetta e ripiega in cellule ospiti. Per capire meglio come la malattia si sviluppa, è necessario da avere un sistema inverso semplice della genetica per il virus.

Tali sistemi sono fatti solitamente facendo uso dei cloni contagiosi che hanno l'intero cDNA virale. Tuttavia, il cDNA per i coronaviruses non è per quanto i genoma virali siano disponibili grandi. Invece, i cromosomi o i frammenti (BAC) artificiali batterici di cDNA si uniscono in vitro.

Ma, questi sistemi presentano i loro svantaggi. Nei sistemi di BAC, ci possono essere mutazioni indesiderate causate dall'amplificazione batterica, che poi richiede il controllo del genoma intero ogni volta, un trattamento che richiede tempo. Unirsi i frammenti del cDNA è un trattamento complicato che richiede la competenza.

Un altro metodo usa la reazione a catena circolare della polimerasi (CPER), per generare i cloni contagiosi dei flaviviruses. i frammenti del cDNA e un frammento del linker sono ampliati da reazione a catena della polimerasi (PCR). I frammenti ampliati sono destinati per comprendere le estremità di sovrapposizione con altri frammenti e quindi possono essere estesi come genoma virale circolare. Questo genoma virale poi è introdotto nelle celle appropriate ed i cloni virali contagiosi sono recuperati.

Istituzione alla della genetica inversa basata CPER per SARS-CoV-2. (A) Rappresentazione schematica di un approccio di CPER per la generazione di SARS-CoV-2 recombinante. Complessivamente 9 frammenti (F1to F8 e F9/10) coprendo l
Istituzione alla della genetica inversa basata CPER per SARS-CoV-2. (A) Rappresentazione schematica di un approccio di CPER per la generazione di SARS-CoV-2 recombinante. Complessivamente 9 frammenti (F1to F8 e F9/10) coprendo l'integrale del genoma SARS-CoV-2 sono stati ampliati, quindi sono stati montati con un frammento del linker di UTR compreso il HDVr, il segnale di polyA di BGH ed il promotore CMV da CPER. I prodotti risultanti di CPER transfected nelle celle suscettibili. (B) le celle di HEK293-3P6C33 transfected con il prodotto di CPER e l'immagine luminosa del campo si è acquistata ad una post-transfezione dei 7 giorni (dpt) (ha andato). Come controllo negativo, il prodotto di CPER ottenuto senza frammento F9/10 transfected nelle celle e l'immagine luminosa del campo è stata ottenuta 7 alla DPT (destra). (C) marcatori genetici (2 mutazioni, A7,486T e T7,489A silenziosi) nel genoma recombinante SARS-CoV-2. (D) confronto della cinetica di crescita del SARS-CoV-2 recombinante generato da CPER con quello dell'isolato originale. Le celle VeroE6/TMPRSS2 sono state infettate con i virus (MOI=0.001 o 0,01) ed i titoli contagiosi nei supernatants della cultura delle celle di SARS-CoV-2-infected sono stati determinati mediante l'analisi TCID50 da 12 a 48 ore di post-infezione (hpi). (E) analisi nordiche della macchia di RNAs subgenomic. RNAs ha estratto dalle celle infettate con il virus parentale e i SARS-CoV-2 recombinanti recuperati da CPER sono stati sottoposti alle analisi nordiche della macchia.

CPER per SARS-CoV-2

In un nuovo studio, un gruppo dei ricercatori ha usato l'approccio di CPER per generare i cloni contagiosi per SARS-CoV-2.

In primo luogo, provare se l'approccio di CPER potesse essere usato per SARS-CoV-2, i ricercatori hanno usato 10 frammenti virali del gene, che hanno riguardato l'intero genoma virale, un frammento del linker, con un promotore per clonare in un plasmide. Poi, hanno usato 10 frammenti del cDNA dei frammenti virali del gene, connessi i 9th e 10th frammenti dalla PCR e da CPER eseguito, quando il cDNA integrale era clone ottenuto.

Per controllare se i prodotti ottenuti fossero possibili, hanno infettato le celle con questi prodotti ed hanno studiato le celle per i cambiamenti a causa dell'infezione virale. Hanno trovato i geni virali recombinanti formati dopo i 7 giorni della transfezione nelle celle, ma soltanto in un tipo di celle, HEK293-3P6C33. Ciò suggerisce che il risparmio di temi di transfezione dei prodotti di CPER ed il risparmio di temi della replica del virus siano importanti da formare un virus recombinante.

Gli autori hanno realizzato l'ordinamento genetico dei virus costituiti dal metodo di CPER, che ha mostrato che non c'era contaminazione del virus ed ha mantenuto i marcatori genetici. Hanno trovato soltanto una differenza nei marcatori genetici del virus P0, mostranti che il sistema inverso della genetica per il SARS-CoV-2 ha avuto alta precisione.

Dopo avere verificato parecchi insiemi della mano di fondo, gli autori hanno trovato che la progettazione delle mani di fondo è importante per il montaggio efficiente del genoma circolare. Quindi, “l'indagine successiva dei termini di CPER (cioè, sequenze del promotore ed insiemi della mano di fondo) per SARS-CoV-2 può migliorare il ripristino dei recombinants,„ scrive gli autori.

I ricercatori egualmente hanno studiato la cinetica del virus recombinante confrontato al virus del genitore SARS-CoV-2. Hanno trovato che la propagazione del virus recombinante era più lenta di quella del virus del genitore, ma hanno raggiunto i livelli simili a quello del virus del genitore.

L'analisi nordica della macchia ha mostrato ad otto RNAs subgenomic, sia nel virus recombinante che nel virus del genitore. Quindi, le caratteristiche biologiche del virus costituito dal metodo di CPER sono simili a quella del virus del genitore.

Aggiunta delle mutazioni

I ricercatori hanno verificato il metodo di CPER per aggiungere i geni del reporter al virus recombinante. Hanno sostituito una sequenza dei nucleotidi nel genoma virale dal gene dello sfGFP.

Sopra l'analisi di sequenza dopo CPER e la fluorescenza difficile di GFP dopo l'espressione della proteina fluorescente in celle, hanno trovato che il virus recombinante ha avuto la mutazione aggiunta. Tuttavia, il tasso di accrescimento del virus mutato era più lento di quello del genitore.

Tuttavia, quando i ricercatori hanno usato NanoBiT, un reporter di spaccatura che ha due sottounità, l'alto-affinità NanoBiT (HiBiT) e grande NanoBiT (LgBiT), la cinetica della crescita era simile a quella del virus selvaggio tipo.

Nella loro prova, hanno inserito il gene di luciferase di HiBiT e una sequenza del linker nel virus SARS-CoV-2 dalla PCR e poi hanno usato CPER per generare SARS-CoV-2 recombinante con HiBiT. Gli studi precedenti hanno indicato che il gene di HiBiT può essere utile per gli esperimenti sugli animali e la selezione della droga.

Ancora, gli autori egualmente hanno mostrato che potrebbero inserire una mutazione nella proteina della punta del virus, che è stato veduto Europa ed in Americhe, senza alcun cambiamento nella cinetica della crescita del virus recombinante.

Quindi, gli autori dicono che il metodo di CPER può essere uno strumento veloce e diretto per sviluppare i vaccini in tensione-attenuati cassaforte e la caratterizzazione delle mutazioni nel virus sopra usando i vaccini o le droghe.

Avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
Lakshmi Supriya

Written by

Lakshmi Supriya

Lakshmi Supriya got her BSc in Industrial Chemistry from IIT Kharagpur (India) and a Ph.D. in Polymer Science and Engineering from Virginia Tech (USA).

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