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Método isento de bactérias para fazer a SARS-CoV-2 clone infecciosos

Usando uma reacção em cadeia circular da polimerase, os pesquisadores desenvolveram um método para fazer o vírus de recombinação do coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2), com a capacidade para introduzir mutações. A pesquisa por cientistas japoneses é publicada sobre o bioRxiv* do server da pré-impressão em setembro de 2020.

Porque a pandemia COVID-19 continua a contaminar cada vez mais povos, há uma grande necessidade de compreender os mecanismos por que o vírus SARS-CoV-2 causa a doença COVID-19, a contamina, e a replicates em pilhas de anfitrião. Para compreender melhor como a doença se torna, é necessário ter um sistema reverso simples da genética para o vírus.

Tais sistemas são feitos geralmente usando os clone infecciosos que têm o cDNA viral inteiro. Contudo, o cDNA para coronaviruses não está por mais disponíveis que os genomas virais sejam grandes. Em lugar de, os cromossomas ou os fragmentos (BAC) artificiais bacterianos do cDNA são juntados junto in vitro.

Mas, estes sistemas têm suas desvantagens. Em sistemas do CCB, pode haver umas mutações indesejadas causadas pela amplificação bacteriana, que exige então a verificação do genoma inteiro todas as vezes, um processo demorado. Juntar-se junto a fragmentos do cDNA é um processo complicado que exige a experiência.

Um outro método usa a reacção em cadeia circular da polimerase (CPER), gerar clone infecciosos dos flaviviruses. os fragmentos do cDNA e um fragmento do linker são amplificados pela reacção em cadeia da polimerase (PCR). Os fragmentos amplificados são projectados incluir extremidades de sobreposição com outros fragmentos, e daqui podem ser estendidos como um genoma viral circular. Este genoma viral é introduzido então nas pilhas apropriadas, e os clone virais infecciosos são recuperados.

Estabelecimento da genética reversa CPER-baseada para SARS-CoV-2. (a) Representação esquemática de uma aproximação de CPER para a geração de SARS-CoV-2 de recombinação. Um total de 9 fragmentos (F1to F8, e de F9/10) cobrindo o completo do genoma SARS-CoV-2 foi amplificado, a seguir montado com um fragmento do linker de UTR que inclui o HDVr, o sinal do polyA de BGH e o promotor CMV por CPER. Os produtos resultantes de CPER transfected nas pilhas suscetíveis. (b) As pilhas HEK293-3P6C33 transfected com o produto de CPER e a imagem brilhante do campo foi adquirida em um cargo-transfection de 7 dias (saiu). Como um controle negativo, o produto de CPER obtido sem fragmento F9/10 transfected em pilhas e a imagem brilhante do campo foi obtida em DPT 7 (direita). (c) Sinais genéticos (2 mutações, A7,486T e T7,489A silenciosos) no genoma SARS-CoV-2 de recombinação. (d) Comparação da cinética do crescimento do SARS-CoV-2 de recombinação gerado por CPER com o aquele do isolado original. As pilhas VeroE6/TMPRSS2 foram contaminadas com os vírus (MOI=0.001 ou 0,01), e os titers infecciosos nos supernatants da cultura das pilhas de SARS-CoV-2-infected foram determinados pelo ensaio TCID50 de 12 a 48 horas de cargo-infecção. (e) Análises do norte da mancha de RNAs subgenomic. RNAs extraiu das pilhas contaminadas com o vírus parental e os SARS-CoV-2 de recombinação recuperados por CPER foram sujeitados às análises do norte da mancha.
Estabelecimento da genética reversa CPER-baseada para SARS-CoV-2. (a) Representação esquemática de uma aproximação de CPER para a geração de SARS-CoV-2 de recombinação. Um total de 9 fragmentos (F1to F8, e de F9/10) cobrindo o completo do genoma SARS-CoV-2 foi amplificado, a seguir montado com um fragmento do linker de UTR que inclui o HDVr, o sinal do polyA de BGH e o promotor CMV por CPER. Os produtos resultantes de CPER transfected nas pilhas suscetíveis. (b) As pilhas HEK293-3P6C33 transfected com o produto de CPER e a imagem brilhante do campo foi adquirida em um cargo-transfection de 7 dias (dpt) (saiu). Como um controle negativo, o produto de CPER obtido sem fragmento F9/10 transfected em pilhas e a imagem brilhante do campo foi obtida em DPT 7 (direita). (c) Sinais genéticos (2 mutações, A7,486T e T7,489A silenciosos) no genoma SARS-CoV-2 de recombinação. (d) Comparação da cinética do crescimento do SARS-CoV-2 de recombinação gerado por CPER com o aquele do isolado original. As pilhas VeroE6/TMPRSS2 foram contaminadas com os vírus (MOI=0.001 ou 0,01), e os titers infecciosos nos supernatants da cultura das pilhas de SARS-CoV-2-infected foram determinados pelo ensaio TCID50 de 12 a 48 horas de cargo-infecção (hpi). (e) Análises do norte da mancha de RNAs subgenomic. RNAs extraiu das pilhas contaminadas com o vírus parental e os SARS-CoV-2 de recombinação recuperados por CPER foram sujeitados às análises do norte da mancha.

CPER para SARS-CoV-2

Em um estudo novo, uma equipe dos pesquisadores usou a aproximação de CPER para gerar clone infecciosos para SARS-CoV-2.

Primeiramente, para testar se a aproximação de CPER poderia ser usada para SARS-CoV-2, os pesquisadores usaram 10 fragmentos virais do gene, que cobriram o genoma viral inteiro, um fragmento do linker, junto com um promotor para clonar em um plasmídeo. Então, usaram 10 fragmentos do cDNA dos fragmentos virais do gene, conectados os 9th e 10th fragmentos pelo PCR, e por CPER executado, quando o cDNA completo era clone obtido.

Para verificar se os produtos obtidos eram viáveis, contaminaram pilhas com estes produtos e estudaram as pilhas para mudanças devido à infecção viral. Encontraram genes virais de recombinação formados após 7 dias do transfection nas pilhas, mas somente em um tipo de pilhas, HEK293-3P6C33. Isto sugere que a eficiência do transfection dos produtos de CPER e a eficiência da réplica do vírus sejam importantes formar um vírus de recombinação.

Os autores executaram arranjar em seqüência genético dos vírus formados pelo método de CPER, que mostrou que não havia nenhuma contaminação do vírus, e manteve os sinais genéticos. Encontraram somente uma diferença nos sinais genéticos do vírus P0, mostrando que o sistema reverso da genética para o SARS-CoV-2 teve a precisão alta.

Após ter testado diversos grupos da primeira demão, os autores encontraram que o projecto das primeiras demão é importante para o conjunto eficiente do genoma circular. Daqui, a “posterior investigação das condições de CPER (isto é, seqüências do promotor e grupos da primeira demão) para SARS-CoV-2 pode aumentar a recuperação dos recombinants,” escreve os autores.

Os pesquisadores igualmente investigaram a cinética do vírus de recombinação comparado ao vírus do pai SARS-CoV-2. Encontraram que a propagação do vírus de recombinação era mais lenta do que aquela do vírus do pai, mas alcançaram os níveis similares àquele do vírus do pai.

A análise do norte da mancha mostrou a oito RNAs subgenomic, no vírus de recombinação e no vírus do pai. Assim, as características biológicas do vírus formado pelo método de CPER são similares àquela do vírus do pai.

Adicionando mutações

Os pesquisadores testaram o método de CPER para adicionar genes do repórter ao vírus de recombinação. Substituíram uma seqüência dos nucleotides no genoma viral pelo gene do sfGFP.

Em cima da análise da seqüência após CPER e da fluorescência de teste de GFP após ter expressado a proteína fluorescente nas pilhas, encontraram que o vírus de recombinação teve a mutação adicionada. Contudo, a taxa de crescimento do vírus transformado era mais lenta do que aquela do pai.

Contudo, quando os pesquisadores usaram NanoBiT, um repórter da separação que tem duas subunidades, alto-afinidade NanoBiT (HiBiT) e grande NanoBiT (LgBiT), a cinética do crescimento era similar àquela do selvagem-tipo vírus.

Em seu teste, introduziram o gene do luciferase de HiBiT e uma seqüência do linker no vírus SARS-CoV-2 pelo PCR e usaram então CPER para gerar SARS-CoV-2 de recombinação com HiBiT. Os estudos precedentes mostraram que o gene de HiBiT pode ser útil para as experiências animais e a selecção da droga.

Além disso, os autores igualmente mostraram que poderiam introduzir uma mutação na proteína do ponto do vírus, que foi visto em Europa e nos Americas, sem nenhuma mudança na cinética do crescimento do vírus de recombinação.

Assim, os autores dizem que o método de CPER pode ser uma ferramenta rápida e directa para desenvolver vacinas vivo-atenuadas cofre forte e caracterizar mutações no vírus em cima de usar vacinas ou drogas.

Observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
Lakshmi Supriya

Written by

Lakshmi Supriya

Lakshmi Supriya got her BSc in Industrial Chemistry from IIT Kharagpur (India) and a Ph.D. in Polymer Science and Engineering from Virginia Tech (USA).

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