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Método sin bacterias para hacer SARS-CoV-2 copias infecciosas

Usando una reacción en cadena circular de polimerasa, los investigadores han desarrollado un método para hacer el virus recombinante del coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de la neumonía asiática, con la capacidad de introducir mutaciones. La investigación de los científicos japoneses se publica sobre el bioRxiv* del servidor de la prueba preliminar en septiembre de 2020.

A medida que el pandémico COVID-19 continúa infectar cada vez más a gente, hay una gran necesidad de entender los mecanismos por los cuales el virus SARS-CoV-2 causa la enfermedad COVID-19, la infecta, y la repliega en células huesped. Para entender mejor cómo la enfermedad se convierte, es necesario tener un sistema reverso simple de la genética para el virus.

Tales sistemas se hacen generalmente usando las copias infecciosas que tienen el cDNA viral entero. Sin embargo, el cDNA para los coronaviruses no está tan disponibles que los genomas virales están grandes. En lugar, los cromosomas o los fragmentos (BAC) artificiales bacterianos del cDNA se ensamblan juntos in vitro.

Pero, estos sistemas tienen sus desventajas. En sistemas del CCB, puede haber mutaciones indeseadas causadas por la amplificación bacteriana, que entonces requiere la verificación del genoma entero cada vez, un proceso que toma tiempo. Ensamblar juntos fragmentos del cDNA es un proceso complicado que requiere experiencia.

Otro método utiliza la reacción en cadena circular de polimerasa (CPER), para generar copias infecciosas de flaviviruses. los fragmentos del cDNA y un fragmento de la máquina para hacer chorizos son amplificados por la reacción en cadena de polimerasa (PCR). Los fragmentos amplificados se diseñan para incluir extremos que recubren con otros fragmentos, y por lo tanto se pueden extender como genoma viral circular. Este genoma viral entonces se introduce en las células apropiadas, y se recuperan las copias virales infecciosas.

Efectivoses de la genética reversa CPER-basada para SARS-CoV-2. (a) Representación esquemática de una aproximación de CPER para la generación de SARS-CoV-2 recombinante. Un total de 9 fragmentos (F1to F8, y F9/10) revistiendo el integral del genoma SARS-CoV-2 fueron amplificados, después montados con un fragmento de la máquina para hacer chorizos de UTR incluyendo el HDVr, la señal del polyA de BGH y el promotor CMV por CPER. Los productos resultantes de CPER transfected en las células susceptibles. (b) Las células HEK293-3P6C33 transfected con el producto de CPER y la imagen brillante del campo fue detectada en la poste-transfección de 7 días (se fue). Como mando negativo, el producto de CPER obtenido sin el fragmento F9/10 transfected en las células y la imagen brillante del campo fue obtenida en dpt 7 (derecho). (c) Marcadores genéticos (2 mutaciones, A7,486T y T7,489A silenciosos) en el genoma recombinante SARS-CoV-2. (d) Comparación de la cinética del incremento del SARS-CoV-2 recombinante generado por CPER con el del aislante original. Las células VeroE6/TMPRSS2 fueron infectadas con los virus (MOI=0.001 o 0,01), y los títulos infecciosos en los supernatants de la cultura de las células de SARS-CoV-2-infected fueron determinados por el análisis TCID50 a partir del 12 a 48 horas de poste-infección. (e) Análisis septentrionales de la mancha blanca /negra de RNAs subgenomic. RNAs extrajo de las células infectadas con el virus parental y los SARS-CoV-2 recombinantes recuperados por CPER fueron sujetados a los análisis septentrionales de la mancha blanca /negra.
Efectivoses de la genética reversa CPER-basada para SARS-CoV-2. (a) Representación esquemática de una aproximación de CPER para la generación de SARS-CoV-2 recombinante. Un total de 9 fragmentos (F1to F8, y F9/10) revistiendo el integral del genoma SARS-CoV-2 fueron amplificados, después montados con un fragmento de la máquina para hacer chorizos de UTR incluyendo el HDVr, la señal del polyA de BGH y el promotor CMV por CPER. Los productos resultantes de CPER transfected en las células susceptibles. (b) Las células HEK293-3P6C33 transfected con el producto de CPER y la imagen brillante del campo fue detectada en la poste-transfección de 7 días (dpt) (se fue). Como mando negativo, el producto de CPER obtenido sin el fragmento F9/10 transfected en las células y la imagen brillante del campo fue obtenida en dpt 7 (derecho). (c) Marcadores genéticos (2 mutaciones, A7,486T y T7,489A silenciosos) en el genoma recombinante SARS-CoV-2. (d) Comparación de la cinética del incremento del SARS-CoV-2 recombinante generado por CPER con el del aislante original. Las células VeroE6/TMPRSS2 fueron infectadas con los virus (MOI=0.001 o 0,01), y los títulos infecciosos en los supernatants de la cultura de las células de SARS-CoV-2-infected fueron determinados por el análisis TCID50 a partir del 12 a 48 horas de poste-infección (hpi). (e) Análisis septentrionales de la mancha blanca /negra de RNAs subgenomic. RNAs extrajo de las células infectadas con el virus parental y los SARS-CoV-2 recombinantes recuperados por CPER fueron sujetados a los análisis septentrionales de la mancha blanca /negra.

CPER para SARS-CoV-2

En un nuevo estudio, las personas de investigadores utilizaron la aproximación de CPER para generar las copias infecciosas para SARS-CoV-2.

Primero, probar si la aproximación de CPER se podría utilizar para SARS-CoV-2, los investigadores utilizaron 10 fragmentos virales del gen, que revistieron el genoma viral entero, un fragmento de la máquina para hacer chorizos, junto con un promotor para reproducirse en un plásmido. Entonces, utilizaron 10 fragmentos del cDNA de los fragmentos virales del gen, conectados los 9th y 10th fragmentos por la polimerización en cadena, y CPER realizado, cuando el cDNA integral era copia obtenida.

Para verificar si los productos obtenidos eran viables, infectaron las células con estos productos y estudiaron las células para los cambios debido a la infección viral. Encontraron genes virales recombinantes formados después de 7 días de transfección en las células, pero solamente en un tipo de células, HEK293-3P6C33. Esto sugiere que la eficiencia de la transfección de los productos de CPER y la eficiencia de la réplica del virus sean importantes formar un virus recombinante.

Los autores realizaron la secuencia genética de los virus formados por el método de CPER, que mostró que no había contaminación del virus, y mantuvo los marcadores genéticos. Encontraron solamente una diferencia en los marcadores genéticos del virus P0, mostrando que el sistema reverso de la genética para el SARS-CoV-2 tenía alta exactitud.

Después de probar varios equipos de la pintura de fondo, los autores encontraron que el diseño de pinturas de fondo es importante para el montaje eficiente del genoma circular. Por lo tanto, la “posterior investigación de las condiciones de CPER (es decir, las series del promotor y los equipos de la pintura de fondo) para SARS-CoV-2 puede aumentar la recuperación de recombinants,” escribe a los autores.

Los investigadores también investigaron la cinética del virus recombinante comparado al virus del padre SARS-CoV-2. Encontraron que la propagación del virus recombinante era más lenta que la del virus del padre, pero alcanzaron los niveles similares al del virus del padre.

El análisis septentrional de la mancha blanca /negra mostró a ocho RNAs subgenomic, en el virus recombinante y el virus del padre. Así, las características biológicas del virus formado por el método de CPER son similares a la del virus del padre.

Agregar mutaciones

Los investigadores probaron el método de CPER para agregar genes del reportero al virus recombinante. Reemplazaron una serie de nucleótidos en el genoma viral por el gen del sfGFP.

Sobre análisis de la serie después de CPER y fluorescencia de prueba de GFP después de expresar la proteína fluorescente en células, encontraron que el virus recombinante tenía la mutación adicional. Sin embargo, la tasa de crecimiento del virus transformado era más lenta que la del padre.

Sin embargo, cuando los investigadores utilizaron NanoBiT, reportero de la hendidura que tenía dos subunidades, alto-afinidad NanoBiT (HiBiT) y NanoBiT grande (LgBiT), la cinética del incremento era similar a la del salvaje-tipo virus.

En su prueba, insertaron el gen del luciferase de HiBiT y una serie de la máquina para hacer chorizos en el virus SARS-CoV-2 por la polimerización en cadena y después utilizaron CPER para generar SARS-CoV-2 recombinante con HiBiT. Los estudios anteriores han mostrado que el gen de HiBiT puede ser útil para las experiencias con animales y la investigación de la droga.

Además, los autores también mostraron que podrían insertar una mutación en la proteína del pico del virus, que se ha visto en Europa y las Américas, sin ningún cambio en la cinética del incremento del virus recombinante.

Así, los autores dicen que el método de CPER puede ser una herramienta rápida y directa para desarrollar vacunas vivo-atenuadas caja fuerte y caracterizar mutaciones en el virus sobre usar vacunas o las drogas.

Advertencia *Important

el bioRxiv publica los partes científicos preliminares que par-no se revisan y, por lo tanto, no se deben mirar como concluyentes, conduce práctica clínica/comportamiento relativo a la salud, o tratado como información establecida.

Journal reference:
Lakshmi Supriya

Written by

Lakshmi Supriya

Lakshmi Supriya got her BSc in Industrial Chemistry from IIT Kharagpur (India) and a Ph.D. in Polymer Science and Engineering from Virginia Tech (USA).

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