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Tempestiva rilevazione di SARS-CoV-2 con al il test diagnostico basato CRISPR portatile del telefono cellulare

Un grande gruppo di ricercatori dagli Stati Uniti ha riferito sviluppare ad un'analisi basata CRISPR senza amplificazione del telefono cellulare per rilevazione diretta del coronavirus 2 (SARS-CoV-2) di sindrome respiratorio acuto severo dai tamponi nasali. Il loro documento avanzato è attualmente disponibile sul " server " della pubblicazione preliminare del medRxiv*.

Una pandemia inesorabile di malattia di coronavirus (COVID-19) causata da SARS-CoV-2 è sorto parzialmente dovuto le sfide dell'identificazione dei portafili sintomatici, asintomatici e presintomatici del virus - con conseguente giro con il loro isolamento in ritardo e diffusione globale massiccia di malattia.

Il sistema monetario aureo diagnostico corrente è la reazione a catena della trascrizione-polimerasi inversa quantitativa (RT-qPCR), che è affidabile ed ampiamente usata per la schermatura degli scopi. Tuttavia, la situazione negli Stati Uniti mostra un lavoro arretrato significativo, con 31% alla della PCR basata a tampone nasale verifica la necessità dei più di quattro giorni per elaborare.

Questo fatto da solo, accoppiato con calare rapido potenziale dell'immunità dopo l'infezione naturale, evidenzia l'esigenza di rapida, opzioni di test di punto-de-cura che possono anche individuare attendibilmente il materiale genetico SARS-CoV-2.

In questo senso, i sistemi diagnostici virali possono trarre giovamento da una riuscita strategia batterica per distruggere i batteriofagi ricevuti (cioè, virus che attaccano i batteri) e per sviluppare una memoria immunologica, che è conosciuta come CRISPR. Gli ultimi possono essere sfruttati per la riuscita e rilevazione rapida di SARS-CoV-2.

Per raggiungere l'alta sensibilità stata necessaria a fini di prova, le strategie diagnostiche correnti di CRISPR soprattutto contano sull'pre-amplificazione dell'acido ribonucleico dell'obiettivo (RNA) per rilevazione successiva da una proteina di Cas.

In un nuovo e studio emozionante, un grande gruppo di ricerca ha riferito il proof of concept di un'analisi diagnostica della rapida CRISPR-Cas13a-based per la rilevazione diretta di RNA SARS-CoV-2.

Disegno schematico di un RNA obbligatorio complesso dell
Disegno schematico di un RNA obbligatorio complesso dell'obiettivo del crRNA di Cas13a (beige) - RNP (rosso) (nero), con conseguente attivazione del dominio della nucleasi di HEPN (denotata dalle forbici). Sopra il riconoscimento dell'obiettivo e l'attivazione di RNP, Cas13a fende indiscriminante un reporter estiguere-fluorophore del RNA, tenendo conto la rilevazione della fluorescenza come proxy per il RNA di attivazione e dell'obiettivo di Cas13a. (B) disegno schematico SARS-CoV-2 del gene del nucleocapsid (n) e le posizioni corrispondenti di ogni regione del distanziatore del crRNA.

Ottimizzazione del dispositivo diagnostico compatto

Per raggiungere questo scopo, i ricercatori in primo luogo hanno dovuto ottimizzare l'attivazione Cas13 con la selezione attenta dei complessi del RNA di CRISPR come pure mettere a punto un sistema di rilevamento sensibile e trasportabile della fluorescenza per questa analisi novella.

La semplicità dell'approccio è stata dimostrata misurando la fluorescenza con una macchina fotografica del telefono cellulare in un'unità confezionata fine, formata dall'ottica a basso costo del lampo e della raccolta del laser.

I ricercatori egualmente hanno combinato i complessi del RNA di CRISPR e di Cas13 (crRNAs) quel RNA dell'obiettivo SARS-CoV-2 per migliorare la sensibilità e la specificità delle soluzioni diagnostiche proposte. Egualmente direttamente hanno quantificato il caricamento virale utilizzando la cinetica degli enzimi.

Un disegno schematico di due RNPs differente che lega alle posizioni differenti dello stesso RNA SARS-CoV-2, piombo alla fenditura del reporter del RNA e della fluorescenza aumentata.
Un disegno schematico di due RNPs differente che lega alle posizioni differenti dello stesso RNA SARS-CoV-2, piombo alla fenditura del reporter del RNA e della fluorescenza aumentata.

Vari avanzamenti chiave

Un avanzamento chiave di questo approccio è una riuscita dimostrazione di come queste combinazioni di crRNAs possono aumentare la sensibilità di rilevazione diretta di Cas13a includendo più Cas13a (che è un sottotipo specifico CRISPR-Cas13) per RNA dell'obiettivo.

“Combinando i crRNAs multipli per aumentare l'attivazione di Cas13a ed analizzando il cambiamento nella fluorescenza col passare del tempo piuttosto che solamente la fluorescenza di punto finale, possiamo raggiungere una rilevazione virale del RNA SARS-CoV-2 di ~100 copies/µL in 30 minuti„, spiegata gli autori di studio. “Egualmente abbiamo identificato correttamente tutti i campioni collaudati pazienti positivi SARS-CoV-2 in 5 minuti„, essi aggiungiamo.

Un altro avanzamento chiave è la possibilità per tradurre direttamente il segnale fluorescente in caricamenti virali. A differenza delle analisi diagnostiche precedenti basate sulla tecnologia di CRISPR, questa non richiede l'pre-amplificazione del genoma virale. Cioè direttamente individuando il RNA virale (senza manipolazioni supplementari), otteniamo le misure quantitative del RNA invece risultato positivo/negativo semplice e binario.

E naturalmente, una sfaccettatura importante supplementare è che ad un'unità basata a telefono mobile semplice può indicare esattamente l'analisi di diretto-rilevazione, evitante l'esigenza di un lettore ingombrante della lastra grossa del laboratorio. Questo concetto già è stato provato negli approcci diagnostici molecolari precedenti, soprattutto amplificazione isotermica ciclo-mediata.

Disegno schematico al del microscopio basato a telefono mobile per rilevazione di fluorescenza che mostra le componenti della raccolta di immagine e di illuminazione (lasciate). Maschera dell
Disegno schematico al del microscopio basato a telefono mobile per rilevazione di fluorescenza che mostra le componenti della raccolta di immagine e di illuminazione (lasciate). Maschera dell'unità montata utilizzata per la raccolta di dati e l'immagine del campione catturate dalla macchina fotografica del telefono cellulare dopo l'esecuzione dell'analisi di Cas13a (destra).

Digiuni, portatile ed accurato

“Qui mostriamo quello la rilevazione diretta di RNA SARS-CoV-2 con CRISPR-Cas13a e le offerte di un telefono cellulare un'opzione di promessa per rapida, prova di punto-de-cura„, riassumono gli autori di studio in questo articolo di promessa del medRxiv.

Le macchine fotografiche del telefono cellulare si sono trasformate in in strumenti altamente sensibili, che (insieme a GPS, a connettività e ad abilità dell'elaborazione dei dati) li hanno trasformati nelle unità attraenti per la diagnosi di malattia di punto-de-cura, particolarmente nelle regioni della basso risorsa.

Combinato con a quantificazione basata a telefono mobile, possiamo realmente vedere il potenziale in questo approccio di permettere a velocemente, portatile, accurato e le opzioni a basso costo per la selezione di punto-de-cura SARS-CoV-2 si adopera.

Andando in avanti, la rilevazione diretta da Cas13a (conformemente al dettaglio in questo documento) può essere modificata rapidamente per mirare all'agente patogeno respiratorio emergente seguente - eventualmente a tempo contribuire ad accorciare la diffusione globale e un'altra pandemia potenzialmente devastante.

Avviso *Important

il medRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
  • Direct detection of SARS-CoV-2 using CRISPR-Cas13a and a mobile phone Parinaz Fozouni, Sungmin Son, María Díaz de León Derby, Gavin J Knott, Carley N Gray, Michael V D'Ambrosio, Chunyu Zhao, Neil A Switz, G. Renuka Kumar, Stephanie I Stephens, Daniela Boehm, Chia-Lin Tsou, Jeffrey Shu, Abdul Bhuiya, Max Armstrong, Andrew Harris, Jeannette M Osterloh, Anke Meyer-Franke, Charles Langelier, Katherine S Pollard, Emily D Crawford, Andreas S Puschnik, Maira Phelps, Amy Kistler, Joseph L DeRisi, Jennifer A Doudna, Daniel A Fletcher, Melanie Ott medRxiv 2020.09.28.20201947; doi: https://doi.org/10.1101/2020.09.28.20201947
Dr. Tomislav Meštrović

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Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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    Meštrović, Tomislav. (2020, October 04). Tempestiva rilevazione di SARS-CoV-2 con al il test diagnostico basato CRISPR portatile del telefono cellulare. News-Medical. Retrieved on November 28, 2020 from https://www.news-medical.net/news/20201004/Rapid-detection-of-SARS-CoV-2-with-portable-CRISPR-based-mobile-phone-diagnostic-test.aspx.

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