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Detecção rápida de SARS-CoV-2 com teste de diagnóstico CRISPR-baseado portátil do telefone móvel

Um grande grupo de pesquisadores dos Estados Unidos relatou desenvolver um ensaio CRISPR-baseado amplificação-livre do telefone móvel para a detecção directa do coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2) dos cotonetes nasais. Seu papel avançado está actualmente disponível no server da pré-impressão do medRxiv*.

Uma pandemia destemido da doença do coronavirus (COVID-19) causada por SARS-CoV-2 elevarou em parte devido aos desafios de identificar portadores sintomáticos, assintomáticos, e presymptomatic do vírus - tendo por resultado a volta com seus isolamento atrasado e propagação global maciça da doença.

A bandeira de ouro diagnóstica actual é a reacção em cadeia reversa quantitativa da transcrição-polimerase (RT-qPCR), que é segura e amplamente utilizada para selecionar finalidades. Contudo, a situação nos Estados Unidos mostra uma reserva significativa, com o 31% do PCR cotonete-baseado nasal testa a necessidade de mais de quatro dias para processar.

Este facto apenas, acoplado com enfraquecer-se rápido potencial da imunidade após a infecção natural, destaca a necessidade para o rapid, as opções do teste do ponto--cuidado que podem igualmente confiantemente detectar o material SARS-CoV-2 genético.

No que respeita, os diagnósticos virais podem tirar proveito de uma estratégia bacteriana bem sucedida para destruir bacteriófagos entrantes (isto é, os vírus que atacam as bactérias) e para construir uma memória imunológica, que seja sabida como CRISPR. Os últimos podem ser explorados para a detecção bem sucedida e rápida de SARS-CoV-2.

Para conseguir a sensibilidade alta necessário para finalidades de teste, as estratégias diagnósticas actuais de CRISPR confiam primeiramente na pre-amplificação do ácido ribonucléico do alvo (RNA) para a detecção subseqüente por uma proteína do Cas.

Em um estudo novo e emocionante, um grande grupo de investigação relatou a prova de conceito de um ensaio diagnóstico rápido de CRISPR-Cas13a-based para a detecção directa do RNA SARS-CoV-2.

Diagrama esquemático de um RNA obrigatório complexo do alvo do crRNA de Cas13a (bege) - RNP (vermelho) (preto), tendo por resultado a activação do domínio da nuclease de HEPN (denotada por tesouras). Em cima do reconhecimento do alvo e da activação de RNP, Cas13a fende indiscriminada um repórter extinguir-fluoróforo do RNA, permitindo a detecção da fluorescência como um proxy para o RNA da activação e do alvo de Cas13a. (b) Diagrama esquemático do nucleocapsid SARS-CoV-2 (N) gene, e os lugar correspondentes de cada região do espaçador do crRNA.
Diagrama esquemático de um RNA obrigatório complexo do alvo do crRNA de Cas13a (bege) - RNP (vermelho) (preto), tendo por resultado a activação do domínio da nuclease de HEPN (denotada por tesouras). Em cima do reconhecimento do alvo e da activação de RNP, Cas13a fende indiscriminada um repórter extinguir-fluoróforo do RNA, permitindo a detecção da fluorescência como um proxy para o RNA da activação e do alvo de Cas13a. (b) Diagrama esquemático do nucleocapsid SARS-CoV-2 (N) gene, e os lugar correspondentes de cada região do espaçador do crRNA.

Aperfeiçoando um dispositivo diagnóstico compacto

A fim conseguir primeiramente este objetivo, os pesquisadores necessários para aperfeiçoar a activação Cas13 com a selecção cuidadosa de complexos do RNA de CRISPR, assim como para desenvolver um sistema de detecção sensível e transportável da fluorescência para este ensaio novo.

A simplicidade da aproximação foi demonstrada medindo a fluorescência com uma câmera do telefone móvel em um dispositivo fim-embalado, compreendido do sistema ótico barato do relâmpago e da coleção do laser.

Os pesquisadores igualmente combinaram complexos do RNA de CRISPR e do Cas13 (crRNAs) esse RNA do alvo SARS-CoV-2 para aumentar a sensibilidade e a especificidade das soluções diagnósticas propor. Têm determinado igualmente directamente a carga viral utilizando a cinética da enzima.

Diagrama esquemático de dois RNPs diferente que liga aos lugar diferentes do mesmo RNA SARS-CoV-2, conduzindo à segmentação do repórter do RNA e da fluorescência aumentada.
Diagrama esquemático de dois RNPs diferente que liga aos lugar diferentes do mesmo RNA SARS-CoV-2, conduzindo à segmentação do repórter do RNA e da fluorescência aumentada.

Diversos avanços chaves

Um avanço chave desta aproximação é uma demonstração bem sucedida de como estas combinações de crRNAs podem aumentar a sensibilidade da detecção directa de Cas13a incluindo mais Cas13a (que é um subtipo CRISPR-Cas13 específico) pelo RNA do alvo.

“Combinando crRNAs múltiplos para aumentar a activação de Cas13a e analisando a mudança na fluorescência ao longo do tempo um pouco do que unicamente a fluorescência do valor-limite, nós podemos conseguir uma detecção viral do RNA SARS-CoV-2 de ~100 copies/µL dentro de 30 minutos”, explicada os autores do estudo. “Nós igualmente identificamos correctamente todas as amostras SARS-CoV-2 pacientes positivas testadas dentro de 5 minutos”, eles adicionamos.

Um outro avanço chave é a possibilidade para traduzir directamente o sinal fluorescente em cargas virais. Ao contrário dos ensaios diagnósticos precedentes baseados na tecnologia de CRISPR, esta não exige a pre-amplificação do genoma viral. Ou seja directamente detectando o RNA viral (sem manipulações adicionais), nós obtemos medidas quantitativas do RNA em vez resultado positivo/negativo simples, binário.

E naturalmente, uma faceta importante adicional é que um dispositivo telefone-baseado móvel simples pode exactamente ler o ensaio da directo-detecção, evitando a necessidade para um leitor volumoso da placa do laboratório. Este conceito foi tentado já em aproximações diagnósticas moleculars precedentes, primeiramente amplificação isothermal laço-negociada.

Diagrama esquemático do microscópio telefone-baseado móvel para a detecção da fluorescência que mostra os componentes da coleção da iluminação e da imagem (deixados). Imagem do dispositivo montado usado para o levantamento de dados e a imagem da amostra tomados pela câmera do telefone móvel após ter executado um ensaio de Cas13a (direito).
Diagrama esquemático do microscópio telefone-baseado móvel para a detecção da fluorescência que mostra os componentes da coleção da iluminação e da imagem (deixados). Imagem do dispositivo montado usado para o levantamento de dados e a imagem da amostra tomados pela câmera do telefone móvel após ter executado um ensaio de Cas13a (direito).

Rápido, portátil e exacto

“Aqui nós mostramos que aquela a detecção directa do RNA SARS-CoV-2 com CRISPR-Cas13a e um telefone móvel oferece a uma opção prometedora para o rapid, teste do ponto--cuidado”, resume autores do estudo neste papel prometedor do medRxiv.

As câmeras do telefone móvel transformaram-se as ferramentas altamente sensíveis, que (junto com o GPS, a conectividade, e capacidades de processo de dados) os transformaram em dispositivos atractivos para o diagnóstico da doença do ponto--cuidado, especialmente em regiões do baixo-recurso.

Combinado com a quantificação telefone-baseada móvel, nós podemos realmente ver o potencial nesta aproximação permitir rapidamente, portable, exacto, e as opções baratas para a selecção do ponto--cuidado SARS-CoV-2 esforçam-se.

Indo para a frente, a detecção directa por Cas13a (de acordo com o detalhe neste papel) pode rapidamente ser alterada para visar o micróbio patogénico respiratório emergente seguinte - esperançosamente a tempo para ajudar a reduzir a propagação global e uma outra pandemia potencial devastador.

Observação *Important

o medRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
  • Direct detection of SARS-CoV-2 using CRISPR-Cas13a and a mobile phone Parinaz Fozouni, Sungmin Son, María Díaz de León Derby, Gavin J Knott, Carley N Gray, Michael V D'Ambrosio, Chunyu Zhao, Neil A Switz, G. Renuka Kumar, Stephanie I Stephens, Daniela Boehm, Chia-Lin Tsou, Jeffrey Shu, Abdul Bhuiya, Max Armstrong, Andrew Harris, Jeannette M Osterloh, Anke Meyer-Franke, Charles Langelier, Katherine S Pollard, Emily D Crawford, Andreas S Puschnik, Maira Phelps, Amy Kistler, Joseph L DeRisi, Jennifer A Doudna, Daniel A Fletcher, Melanie Ott medRxiv 2020.09.28.20201947; doi: https://doi.org/10.1101/2020.09.28.20201947
Dr. Tomislav Meštrović

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Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

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