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Detección rápida de SARS-CoV-2 con la prueba diagnóstica CRISPR-basada portátil del teléfono movible

Un grupo grande de investigadores de los Estados Unidos denunció desarrollar un análisis CRISPR-basado amplificación-libre del teléfono movible para la detección directa del coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de la neumonía asiática de los lampazos nasales. Su papel avanzado está actualmente disponible en el servidor de la prueba preliminar del medRxiv*.

Un pandémico implacable de la enfermedad del coronavirus (COVID-19) causado por SARS-CoV-2 se presentó en parte debido a los retos de determinar las ondas portadoras sintomáticas, asintomáticas, y presintomáticas del virus - dando por resultado giro con su aislamiento demorado y extensión global masiva de la enfermedad.

El patrón oro diagnóstico actual es la reacción en cadena reversa cuantitativa de la transcripción-polimerasa (RT-qPCR), que es segura y ampliamente utilizada para revisar propósitos. Sin embargo, la situación en los Estados Unidos muestra una reserva importante, con el 31% de la polimerización en cadena lampazo-basada nasal prueba la necesidad de más de cuatro días para tramitar.

Este hecho solamente, acoplado con una disminución rápida potencial de la inmunidad después de la infección natural, destaca la necesidad del rapid, las opciones de la prueba del punto-de-cuidado que pueden también descubrir seguro el material genético SARS-CoV-2.

A este respecto, los diagnósticos virales pueden beneficiarse de una estrategia bacteriana acertada para destruir los bacteriófagos entrantes (es decir, los virus que atacan bacterias) y para construir una memoria inmunológica, que se conoce como CRISPR. Estes último se pueden explotar para la detección acertada y rápida de SARS-CoV-2.

Para lograr la alta sensibilidad necesaria para comprobar, las estrategias diagnósticas actuales de CRISPR confían sobre todo en la pre-amplificación del ácido ribonucleico del objetivo (ARN) para la detección subsiguiente por una proteína del Cas.

En un nuevo y emocionante estudio, un grupo de investigación grande denunció la prueba del concepto de un análisis diagnóstico rápido de CRISPR-Cas13a-based para la detección directa del ARN SARS-CoV-2.

Diagrama esquemático de un ARN obligatorio complejo del objetivo del crRNA de Cas13a (beige) - RNP (rojo) (negro), dando por resultado la activación del dominio de la nucleasa de HEPN (denotada por las tijeras). Sobre el reconocimiento del objetivo y la activación de RNP, Cas13a hiende indistintamente a un reportero apagar-fluoróforo del ARN, teniendo en cuenta la detección de la fluorescencia como poder para el ARN de la activación y del objetivo de Cas13a. (b) Diagrama esquemático SARS-CoV-2 del gen del nucleocapsid (n), y las situaciones correspondientes de cada región del espaciador del crRNA.
Diagrama esquemático de un ARN obligatorio complejo del objetivo del crRNA de Cas13a (beige) - RNP (rojo) (negro), dando por resultado la activación del dominio de la nucleasa de HEPN (denotada por las tijeras). Sobre el reconocimiento del objetivo y la activación de RNP, Cas13a hiende indistintamente a un reportero apagar-fluoróforo del ARN, teniendo en cuenta la detección de la fluorescencia como poder para el ARN de la activación y del objetivo de Cas13a. (b) Diagrama esquemático SARS-CoV-2 del gen del nucleocapsid (n), y las situaciones correspondientes de cada región del espaciador del crRNA.

Optimización de un dispositivo diagnóstico compacto

Para lograr esta meta, los investigadores primero necesitaron optimizar la activación Cas13 con la selección cuidadosa de complejos del ARN de CRISPR, así como desarrollar un sistema de detección sensible y transportable de la fluorescencia para este análisis nuevo.

La simplicidad de la aproximación fue demostrada midiendo fluorescencia con una cámara del teléfono movible en un dispositivo cierre-cargado, comprendido de la óptica barata del relámpago y de la colección del laser.

Los investigadores también han combinado complejos del ARN y de Cas13 (crRNAs) de CRISPR ese ARN del objetivo SARS-CoV-2 para aumentar la sensibilidad y la especificidad de las soluciones diagnósticas propuestas. También han cuantificado directamente la carga viral utilizando la cinética de la enzima.

Diagrama esquemático de dos diverso RNPs que ata a las ubicaciones diferentes del mismo ARN SARS-CoV-2, llevando a la hendidura del reportero del ARN y de la fluorescencia creciente.
Diagrama esquemático de dos diverso RNPs que ata a las ubicaciones diferentes del mismo ARN SARS-CoV-2, llevando a la hendidura del reportero del ARN y de la fluorescencia creciente.

Varios avances dominantes

Un avance dominante de esta aproximación es una demostración acertada de cómo estas combinaciones de crRNAs pueden aumentar la sensibilidad de la detección directa de Cas13a incluyendo más Cas13a (que sea un subtipo específico CRISPR-Cas13) por el ARN del objetivo.

“Combinando crRNAs múltiples para aumentar la activación de Cas13a y analizando el cambio en fluorescencia en un cierto plazo bastante que solamente fluorescencia de la punto final, podemos lograr la detección viral del ARN SARS-CoV-2 de ~100 copies/µL en el plazo de 30 minutos”, explicada los autores del estudio. “También determinamos correctamente todas las muestras pacientes positivas SARS-CoV-2 probadas en el plazo de 5 minutos”, ellos agregamos.

Otro avance dominante es la posibilidad para traducir la señal fluorescente a cargas virales directamente. A diferencia de los análisis diagnósticos anteriores basados en tecnología de CRISPR, ésta no requiere la pre-amplificación del genoma viral. Es decir directamente descubriendo el ARN viral (sin manipulaciones adicionales), conseguimos mediciones cuantitativas del ARN en vez de un resultado positivo/negativo simple, binario.

Y por supuesto, una faceta importante adicional es que un dispositivo teléfono-basado movible simple puede leer exacto el análisis de la directo-detección, evitando la necesidad de un programa de lectura abultado de la placa del laboratorio. Este concepto fue intentado ya en las aproximaciones diagnósticas moleculares anteriores, sobre todo amplificación isotérmica rizo-mediada.

Diagrama esquemático del microscopio teléfono-basado movible para la detección de la fluorescencia que muestra los componentes de la colección de la iluminación y de la imagen (dejados). Retrato del dispositivo montado usado para la colección de datos y la imagen de la muestra tomadas por la cámara del teléfono movible después de funcionar con un análisis de Cas13a (correcto).
Diagrama esquemático del microscopio teléfono-basado movible para la detección de la fluorescencia que muestra los componentes de la colección de la iluminación y de la imagen (dejados). Retrato del dispositivo montado usado para la colección de datos y la imagen de la muestra tomadas por la cámara del teléfono movible después de funcionar con un análisis de Cas13a (correcto).

Rápido, portátil y exacto

“Aquí mostramos que eso la detección directa del ARN SARS-CoV-2 con CRISPR-Cas13a y un teléfono movible ofrece a opción prometedora para el rapid, prueba del punto-de-cuidado”, resume a autores del estudio en este papel prometedor del medRxiv.

Las cámaras del teléfono movible se convirtieron en las herramientas altamente sensibles, que (así como GPS, conectividad, y capacidades de proceso de datos) las han girado en los dispositivos atractivos para la diagnosis de la enfermedad del punto-de-cuidado, especialmente en regiones del inferior-recurso.

Combinado con la cuantificación teléfono-basada movible, podemos ver realmente el potencial en esta aproximación de habilitar rápidamente, portable, exacto, y las opciones baratas para la investigación del punto-de-cuidado SARS-CoV-2 se esfuerzan.

Yendo adelante, la detección directa por Cas13a (de acuerdo con el detalle en este papel) se puede modificar rápidamente para apuntar el patógeno respiratorio emergente siguiente - esperanzadamente a tiempo para ayudar a acortar la extensión global y otro pandémico potencialmente devastador.

Advertencia *Important

el medRxiv publica los partes científicos preliminares que par-no se revisan y, por lo tanto, no se deben mirar como concluyentes, conduce práctica clínica/comportamiento relativo a la salud, o tratado como información establecida.

Journal reference:
  • Direct detection of SARS-CoV-2 using CRISPR-Cas13a and a mobile phone Parinaz Fozouni, Sungmin Son, María Díaz de León Derby, Gavin J Knott, Carley N Gray, Michael V D'Ambrosio, Chunyu Zhao, Neil A Switz, G. Renuka Kumar, Stephanie I Stephens, Daniela Boehm, Chia-Lin Tsou, Jeffrey Shu, Abdul Bhuiya, Max Armstrong, Andrew Harris, Jeannette M Osterloh, Anke Meyer-Franke, Charles Langelier, Katherine S Pollard, Emily D Crawford, Andreas S Puschnik, Maira Phelps, Amy Kistler, Joseph L DeRisi, Jennifer A Doudna, Daniel A Fletcher, Melanie Ott medRxiv 2020.09.28.20201947; doi: https://doi.org/10.1101/2020.09.28.20201947
Dr. Tomislav Meštrović

Written by

Dr. Tomislav Meštrović

Dr. Tomislav Meštrović is a medical doctor (MD) with a Ph.D. in biomedical and health sciences, specialist in the field of clinical microbiology, and an Assistant Professor at Croatia's youngest university - University North. In addition to his interest in clinical, research and lecturing activities, his immense passion for medical writing and scientific communication goes back to his student days. He enjoys contributing back to the community. In his spare time, Tomislav is a movie buff and an avid traveler.

Citations

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