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Production de six anticorps monoclonaux contre la protéine de la pointe SARS-CoV-2

La pandémie du coronavirus 2 de syndrôme respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2) est prévue par quelques experts pour être autour pendant plusieurs années. Cette hypothèse alarmante oblige intervention thérapeutique rapide et couronnée de succès à atténuer cette infection. Dans cet effort, des anticorps monoclonaux recombinés variés d'origine humaine qui neutralisent l'infection SARS-CoV-2 ont été isolés dans les patients convalescents. Cependant, le besoin d'anticorps monoclonaux spécifiques dans la recherche en matière moléculaire de pathologie n'est pas entièrement satisfait ; ces anticorps peuvent être employés pour disséquer le mécanisme moléculaire de la durée de vie utile de virus.

Youjia Guo et autres dans un papier récent de prétirage de bioRxiv* expliquent le rendement robuste des anticorps monoclonaux de pointe de la souris anti-SARS-CoV-2 dans les immunoessais, y compris éponger occidental, ELISA, immunofluorescence, et activité d'immunoprécipitation et également de neutralisation in vitro contre l'infection SARS-CoV-2. Des anticorps monoclonaux sont produits par un clone des cellules immunitaires contre un épitope de l'antigène. Puisque les anticorps utilisés dans cette étude sont d'origine de souris, elle les rend compatibles avec les installations expérimentales d'immunoessai utilisées généralement dans les laboratoires de recherche fondamentaux de biologie moléculaire mondial ; la technologie conventionnelle d'hybridome de souris garantit également la production à grande échelle et la distribution facile.

Cette technologie fournit une source fiable des anticorps monoclonaux de souris (Kohler et Milstein, 1975). Les anticorps humanisés de souris et le rétablissement suivant des anticorps entièrement humains par des techniques variées sont très utilisés pour différents traitements. Par exemple, Palivizumab, un virus respiratoire syncytial de neutralisation humanisé d'anticorps monoclonal de souris (RSV), est employé dans les réglages cliniques prophylactique pour protéger les mineurs vulnérables. Avec cette approche, l'immunisation passive avec de l'anticorps monoclonal est actuel considérée comme demande de règlement pour COVID-19.

Tandis qu'un grand nombre d'anticorps de neutralisation sont rapportés pour empêcher l'infection SARS-CoV-2, les auteurs arguent du fait qu'il y a toujours un manque primordialement de caractéristiques sur un anticorps bien-caractérisé procurable pour des techniques de recherche fondamentale telles qu'éponger, immunofluorescence, et immunoprécipitation occidentales pour étudier la durée de vie utile virale. Avec ce besoin à l'esprit, ils déterminent six anticorps monoclonaux contre la glycoprotéine de pointe de SARS-CoV-2 et enregistrent l'atténuation de l'interaction virale avec des cellules in vitro. Les résultats observés dans l'étude sont récapitulés ci-après.

Inhibition d
Inhibition d'interaction d'ACE2-spike par S1D7 et S3D8 A. Un schéma de l'analyse déroulante de pointe a conçu pour évaluer l'inhibition de la pointe d'ACE2- grippant par l'anticorps monoclonal. La glycoprotéine de pointe manquant du domaine du TM (SΔTM) a été mélangée à de l'anticorps monoclonal. ACE2-SBP a été appliqué pour capter SΔTM sur des talons de streptavidin compétitif. SΔTM capté a été trouvé par le WB comme mesure de la capacité inhibitrice de l'anticorps. S1, S1D7 ; S3, S3D8 ; Ni, souris non immunisée IgG. WB de B. d'analyse déroulante de pointe utilisant l'anticorps R52. En présence des clones S1D7 et S3D8, ACE2 ne pouvait pas abaisser SΔTM. C. Le schéma de l'analyse talon talon de neutralisation a conçu pour mesurer l'inhibition d'ACE2-RBD grippant par l'anticorps monoclonal. La glycoprotéine de RBD-SBP immobilisée sur des talons de streptavidin a été mélangée à de l'anticorps monoclonal. ACE2-FLAG a été appliqué pour gripper compétitif avec RBD. Le grippement d'ACE2-RBD a été mesuré en mesurant le signe donné par un anticorps d'anti-INDICATEUR conjugué avec le VBTT fluorophore utilisant FACS.

Production de six anticorps monoclonaux contre la glycoprotéine de pointe

La glycoprotéine de la pointe SARS-CoV-2 est une protéine homotrimeric de fusion composée de deux sous-unités : S1 et S2. Les chercheurs ont suivi la méthodologie développée par Wrapp et autres, 2020 - dans ce que la protéine de la pointe SARS-CoV-2 a été conçue pour former un homotrimer stable qui était résistant à la protéolyse pendant la préparation de protéine. Les souris ont été immunisées avec ces protéines recombinées de pointe pour produire des anticorps anti-SARS-CoV-2, suivis de fusion de cellules pour produire d'un anticorps producteur d'hybridome. Dans cette étude, après que les supernatants de culture pré-aient été examinés, six hybridomes monoclonaux ont été isolés et évalués.

Les anticorps ont été purifiés de la culture surnageante et en détail caractérisés, avec le rendement d'ELISA et de WB.

Les anticorps S1D7 et S3D8 ont montré une plus haute performance sur IP (immunoprécipitation) et SI (l'immunofluorescence)

Pour comprendre le mécanisme moléculaire de l'infection SARS-CoV-2, particulièrement l'entrée de cellules, où ces protéines jouent un rôle important, l'anticorps doit identifier la structure tertiaire intacte des protéines de pointe. L'activité d'IP des anticorps peut être marquée avec capter la structure indigène de la protéine cible et utiliser l'infection. Tous les clones étaient capables de l'immunoprécipitation avec le RBD et des glycoprotéines de l'ectodomain (S∆TM) avec un rendement d'IP de différentiel. L'analyse d'immunofluorescence réfléchit la localisation cellulaire des protéines de pointe, qui élucident le mécanisme de l'emballage et la maturation du degré de liberté pendant le desserrage de la membrane cellulaire.

Inhibition obligatoire d'ACE2-Spike des anticorps monoclonaux

Les auteurs prouvent dans cette étude que l'interaction spike-ACE2 est arrêtée par le grippement compétitif entre les anticorps et la glycoprotéine de neutralisation de pointe - ainsi, empêchant le spike-ACE2 grippant ou même neutralisant l'infection SARS-CoV-2. Ils ont également mesuré la capacité d'inhibition, utilisant une analyse talon talon de neutralisation en mesurant la quantité de la limite ACE2 aux talons de RBD après blocage avec des anticorps monoclonaux.

S1D7 et S3D8 ont montré l'activité de neutralisation contre SARS-CoV-2

Puis, les chercheurs ont déterminé la capacité de l'anticorps d'empêcher l'infection SARS-CoV-2 en cellules VeroE6/TM2. Ces cellules sont une infection par un virus plus encline que la lignée cellulaire VeroE6 couramment adoptée. Deux des six anticorps utilisés dans l'étude ont bloqué de manière significative l'infection SARS-CoV-2 avec les valeurs IC50 de 405,2 ng/ml et de 139 ng/ml, respectivement. Quand les chercheurs ont mélangé ces deux anticorps, le cocktail a montré l'activité de neutralisation intermédiaire, proposant un mécanisme inhibiteur partagé.

Les auteurs déclarent que les anticorps de souris utilisés dans cette étude ne s'appliquent pas à la demande de règlement clinique. Cependant, ils peuvent être employés pour vérifier le mécanisme des réactions immunitaires pendant l'immunisation passive utilisant des modèles de souris pour l'infection SARS-CoV-2. Une présentation approfondie dans les connaissances de base de la façon dont ce les attaques virales a des implications significatives pour des contre-mesures et également le diagnostic se développant, le modèle vaccinique, et la découverte de médicaments.

Avis *Important

le bioRxiv publie les états scientifiques préliminaires qui pair-ne sont pas observés et ne devraient pas, en conséquence, être considérés comme concluants, guident la pratique clinique/comportement relatif à la santé, ou traité en tant qu'information déterminée.

Journal reference:
  • Potent mouse monoclonal antibodies that block SARS-CoV-2 infection, Youjia Guo, Atsushi Kawaguchi, Masaru Takeshita, Takeshi Sekiya, Mikako Hirohama, Akio Yamashita, the Keio Donner Project, Haruhiko Siomi, Kensaku Murano, bioRxiv 2020.10.01.323220; doi: https://doi.org/10.1101/2020.10.01.323220
Dr. Ramya Dwivedi

Written by

Dr. Ramya Dwivedi

Ramya has a Ph.D. in Biotechnology from the National Chemical Laboratories (CSIR-NCL), in Pune. Her work consisted of functionalizing nanoparticles with different molecules of biological interest, studying the reaction system and establishing useful applications.

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