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Utilisant les particules de type viral pour étudier l'ensemble SARS-CoV-2, le bourgeonnement, et l'entrée

Le coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de syndrôme respiratoire aigu sévère a apparu la première fois en décembre 2019 à Wuhan, Chine, et s'est rapidement écarté à d'autres pays, entraînant une pandémie globale sans précédent.

Aujourd'hui, le virus s'est écarté à 207 pays, avec 35,65 millions de cas confirmés mondial et plus de 1,04 millions de morts. Bien qu'on le connaisse de l'expérience précédente avec SARS-CoV-1 et le syndrome respiratoire de Moyen-Orient (MERS) que les coronaviruses sont hautement virulents, il ne reste aucun vaccin ou médicament approuvé par le FDA pour n'importe quel coronavirus.

Puisque SARS-CoV-2 est étroitement lié aux coronaviruses de SARS-CoV-1 et de MERS, il est classifié comme agents choisis du groupe à risque 3, qui signifie que l'utilisation des virus sous tension est limitée aux installations du niveau 3 de sécurité biologique (BSL-3). Ceci rend la recherche SARS-CoV-2 inaccessible à la plupart des laboratoires de recherche de fonctionnement aux USA, empêchant un effort scientifique collectif appels d'une cette tels pandémie pour.

Produire les modèles BSL-2 pour faciliter la recherche virale

Le développement des modèles BSL-2 et des analyses viraux compatibles est impérieux pour faciliter l'étude des approches thérapeutiques virales de bourgeonnement et d'entrée et de potentiel. Dans le passé, les modèles BSL-2 de l'autre BSL-3 hautement virulent et -4 agents pathogènes, y compris SARS-CoV-1, le virus de MERS, de virus Ebola, et de Lassa, ont été développés sous forme de particules de type viral (VLPs).

SARS-CoV-2, comme d'autres coronaviruses, emploie l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2), le récepteur de surface de cellule humaine, pour activer la prise cellulaire des particules virales. Les 4 protéines de structure du virus - clouez (s), membrane (m), nucleocapsid (n), et enveloppe (e) - sont dites responsables de mettre à jour l'intégrité structurelle du virion SARS-CoV-2.

Dans un papier récent de prétirage publié sur le serveur de bioRxiv*, les chercheurs de l'institut de Purdue de l'inflammation, l'immunologie, et la maladie infectieuse, Université de Purdue, Lafayette occidental, DEDANS, discutent leurs efforts pour évaluer les 4 protéines de structure SARS-CoV-2 pour que leur capacité produise VLPs à partir des cellules humaines pour produire un système compétent pour les études BSL-2 de SARS-CoV-2. L'étude a visé à développer VLPs qui sont morphologiquement et fonctionellement approprié que bourgeonnement et entrée de l'étude SARS-CoV-2 d'aide.

Dans leur travail, l'équipe de recherche fournit des méthodes et des moyens pour la production, la purification, et fluorescent et APEX2-labeling de SARS-CoV-2 VLPs, qui peut aider à évaluer les mécanismes viraux de bourgeonnement et d'entrée et l'analyse des inhibiteurs de médicament dans les états BSL-2.

Microscopie électronique de lecture des cellules virales de transfecté de protéine de structure. Les cellules HEK293 ont été injectées sur des lamelles et la transfecté individuellement ou en combination avec M, N, E, et/ou S. Cells ont été fixées avec du glutaraldéhyde pendant 72 heures de goujon-transfection et maintenues à 4°C jusqu
Microscopie électronique de lecture des cellules virales de transfecté de protéine de structure. Les cellules HEK293 ont été injectées sur des lamelles et la transfecté individuellement ou en combination avec M, N, E, et/ou S. Cells ont été fixées avec du glutaraldéhyde pendant 72 heures de goujon-transfection et maintenues à 4°C jusqu'à ce que fixe avec du tétroxyde d'osmium. Les échantillons étaient alors graduellement déshydratés avec de l'éthanol et complet déshydratés avec un dessiccateur de remarque critique. Une fois que déshydratés, des échantillons ont été montés sur les chevilles en aluminium avec la bande double face de carbone, chargée de la peinture argentée, et pulvérisent enduit avant la représentation. Les images s'échelonnent dans l'agrandissement de 10,000x à 80,000x.

Un modèle réaliste de l'entrée SARS-CoV-2 virale procurable dans le réglage BSL-2

Car la pandémie SARS-CoV-2 continue à faire rage en circuit, il est indispensable que plus de travail soit effectué vers améliorer notre compréhension principale des mécanismes moléculaires du virus. Dans cette étude, l'équipe a analysé la capacité des protéines de structure SARS-CoV-2 de former VLPs et de constater que seule la protéine de M n'était pas suffisante pour la formation de VLP, mais la Co-expression de M avec des protéines de N ou de S était essentielle pour former VLPs. Ils ont également constaté que la protéine d'E a une synergie additive dans la constitution de N dans VLPs ainsi que dans la production de VLP, qui met en valeur la fonction clé de jeux d'E dans l'ensemble et le desserrage du virus.

Selon les auteurs, leurs découvertes présentent à un SARS-CoV-2 neuf le modèle d'entrée viral dans un réglage BSL-2 : SARS-CoV-2 GFP- et APEX2-VLPs. Selon des caractéristiques sous tension de virus, GFP-VLPs colocalize avec Rab5, la borne endosome tôt, et LAMP1, la borne endosome tardive.

« Dans ce travail, nous présentons également pour la première fois un modèle réaliste de l'entrée SARS-CoV-2 virale procurable dans un réglage BSL-2 : SARS-CoV-2 GFP- et APEX2-VLPs. Selon des caractéristiques sous tension de virus, GFP-VLPs colocalize avec la borne endosome tôt, Rab5, et la borne endosome tardive, LAMP1. »

L'équipe planification pour concentrer leurs travaux futurs sur miniaturiser leur analyse d'entrée de GFP-VLP et l'utiliser dans l'examen critique des inhibiteurs viraux de prise et d'entrée.  Indépendamment d'employer la microscopie confocale pour évaluer des événements d'entrée de GFP-VLP, ils ont également utilisé l'APEX étiquetant la technologie pour permettre pour employer la microscopie électronique pour le bilan de l'entrée SARS-CoV-2.

Les approches traditionnelles pour expliquer les structures comme VLP utilisant TEM basent leur identification seulement sur la morphologie. À l'aide de l'APEX étiquetant, l'équipe pouvait montrer la localisation de protéine de S pendant l'ensemble de VLP et le bourgeonnement et également la formation et l'exportation du l'Apex-VLPs du lumen d'ERGIC.

« Au total, cette recherche fournit les moyens suffisants pour d'autres laboratoires BSL-2 intéressés à joindre l'inducteur croissant pour essayer et comprendre l'ensemble SARS-CoV-2, le bourgeonnement, et la dynamique d'entrée, les questions biochimiques et biophysiques sur les quatre protéines de structure, et le dépistage des drogues de l'ensemble, du bourgeonnement, ou des inhibiteurs viraux d'entrée. »

Avis *Important

le bioRxiv publie les états scientifiques préliminaires qui pair-ne sont pas observés et ne devraient pas, en conséquence, être considérés comme concluants, guident la pratique clinique/comportement relatif à la santé, ou traité en tant qu'information déterminée.

Journal reference:
Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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