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Usando-se vírus-como partículas para estudar o conjunto SARS-CoV-2, brotando, e entrada

O coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2) emergiu primeiramente em dezembro de 2019 em Wuhan, China, e espalhou ràpida a outros países, causando uma pandemia global inaudita.

Hoje, o vírus espalhou a 207 países, com 35,65 milhão casos confirmados global e sobre 1,04 milhão fatalidades. Embora se saiba da experiência precedente com SARS-CoV-1 e a síndrome respiratória de Médio Oriente (MERS) que os coronaviruses são altamente virulentos, não há ainda nenhuma vacina ou droga aprovado pelo FDA para nenhum coronavirus.

Desde que SARS-CoV-2 é estreitamente relacionado aos coronaviruses de SARS-CoV-1 e de MERS, é classificado como agentes seletos do grupo de risco 3, que significa que o uso dos vírus vivos está restringido às facilidades do nível 3 da seguridade biológica (BSL-3). Isto faz a pesquisa SARS-CoV-2 inacessível à maioria de laboratórios de investigação de funcionamento nos E.U., inibindo um esforço científico colectivo que tal pandemia chame para.

Criando os modelos BSL-2 para facilitar a pesquisa viral

A revelação dos modelos BSL-2 e ensaios virais compatíveis é imperativa facilitar o estudo da brotamento viral e a entrada e aproximações terapêuticas potenciais. No passado, nos modelos BSL-2 do outro BSL-3 altamente virulento e nos -4 micróbios patogénicos, incluindo SARS-CoV-1, MERS, o vírus de Ebola, e o vírus de Lassa, foram desenvolvidos sob a forma vírus-como das partículas (VLPs).

SARS-CoV-2, como outros coronaviruses, usa a angiotensin-conversão da enzima 2 (ACE2), o receptor da superfície da pilha humana, para permitir a tomada celular de partículas virais. As 4 proteínas estruturais do vírus - crave (s), membrana (M), nucleocapsid (N), e envelope (e) - seriam responsáveis para manter a integridade estrutural do virion SARS-CoV-2.

Em um papel recente da pré-impressão publicado no server do bioRxiv*, os pesquisadores do instituto de Purdue da inflamação, a imunologia, e a doença infecciosa, universidade de Purdue, Lafayette ocidental, DENTRO, discutem seus esforços para avaliar as 4 proteínas SARS-CoV-2 estruturais para que sua capacidade produza VLPs das pilhas humanas para criar um sistema competente para os estudos BSL-2 de SARS-CoV-2. O estudo apontou desenvolver VLPs que é morfològica e funcional relevante que o estudo brotamento e entrada de SARS-CoV-2 da ajuda.

Em seu trabalho, a equipe dos pesquisadores fornece métodos e recursos para a produção, a purificação, e o fluorescente e APEX2-labeling de SARS-CoV-2 VLPs, que pode ajudar a avaliar mecanismos virais da brotamento e da entrada e análise de inibidores da droga sob as condições BSL-2.

A microscopia de elétron da exploração da proteína estrutural viral transfected pilhas. As pilhas HEK293 foram semeadas em lamelas e transfected individualmente ou em combinação com M, N, E, e/ou S. Pilha estiveram fixados com glutaraldehyde 72 horas de cargo-transfection e mantidos em 4°C até que fixado com tetroxide do ósmio. As amostras foram desidratadas então gradualmente com álcool etílico e desidratadas completamente com um secador do ponto crítico. Uma vez que desidratadas, as amostras foram montadas nos pinos de alumínio com a fita frente e verso do carbono, cobrada com a pintura de prata, e engasgam revestido antes da imagem lactente. As imagens variam na ampliação de 10,000x a 80,000x.
A microscopia de elétron da exploração da proteína estrutural viral transfected pilhas. As pilhas HEK293 foram semeadas em lamelas e transfected individualmente ou em combinação com M, N, E, e/ou S. Pilha estiveram fixados com glutaraldehyde 72 horas de cargo-transfection e mantidos em 4°C até que fixado com tetroxide do ósmio. As amostras foram desidratadas então gradualmente com álcool etílico e desidratadas completamente com um secador do ponto crítico. Uma vez que desidratadas, as amostras foram montadas nos pinos de alumínio com a fita frente e verso do carbono, cobrada com a pintura de prata, e engasgam revestido antes da imagem lactente. As imagens variam na ampliação de 10,000x a 80,000x.

Um modelo realístico da entrada SARS-CoV-2 viral disponível no ajuste BSL-2

Porque a pandemia SARS-CoV-2 continua a rage sobre, é vital que mais trabalho está feito para o melhoramento de nossa compreensão fundamental dos mecanismos moleculars do vírus. Neste estudo, a equipe analisou a capacidade das proteínas SARS-CoV-2 estruturais para formar VLPs e encontrar que a proteína de M apenas não era suficiente para a formação de VLP, mas a co-expressão de M com proteínas de N ou de S era essencial para formar VLPs. Igualmente encontraram que a proteína de E tem um efeito aditivo na incorporação de N em VLPs assim como na produção de VLP, que destaca os jogos do papel chave E no conjunto e na liberação do vírus.

De acordo com os autores, seus resultados apresentam a um SARS-CoV-2 novo o modelo de entrada viral em um ajuste BSL-2: SARS-CoV-2 GFP- e APEX2-VLPs. De acordo com dados vivos do vírus, GFP-VLPs colocalize com Rab5, o marcador endosome adiantado, e o LAMP1, o marcador endosome atrasado.

“Neste trabalho, nós igualmente apresentamos pela primeira vez um modelo realístico da entrada SARS-CoV-2 viral disponível em um ajuste BSL-2: SARS-CoV-2 GFP- e APEX2-VLPs. De acordo com dados vivos do vírus, GFP-VLPs colocalize com o marcador endosome adiantado, o Rab5, e o marcador endosome atrasado, LAMP1.”

A equipe planeia focalizar seu trabalho futuro em miniaturizar seu ensaio da entrada de GFP-VLP e em utilizá-lo na selecção de inibidores virais da tomada e da entrada.  Independentemente de usar a microscopia confocal para avaliar eventos da entrada de GFP-VLP, igualmente utilizaram o VÉRTICE que etiqueta a tecnologia para torná-la possível usar a microscopia de elétron para a avaliação da entrada SARS-CoV-2.

As aproximações tradicionais a demonstrar VLP-como as estruturas que usam TEM baseiam sua identificação unicamente na morfologia. Usando o VÉRTICE que etiqueta, a equipe podia mostrar a localização da proteína de S durante o conjunto de VLP e a brotamento e igualmente a formação e a exportação do Vértice-VLPs do lúmen de ERGIC.

“No total, esta pesquisa fornece recursos amplos para outros laboratórios BSL-2 interessados em juntar-se o campo crescente para tentar e compreender o conjunto SARS-CoV-2, na brotamento, e na dinâmica da entrada, em perguntas bioquímicas e biofísicas nas quatro proteínas estruturais, e em selecção da droga do conjunto viral, da brotamento, ou dos inibidores da entrada.”

Observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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