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Usando las partículas de tipo virus para estudiar el montaje SARS-CoV-2, el florecimiento, y el asiento

El coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de la neumonía asiática primero emergió en diciembre de 2019 en Wuhan, China, y se extendió rápidamente a otros países, causando un pandémico global sin precedente.

Hoy, el virus se ha extendido a 207 países, con 35,65 millones de casos confirmados global y sobre 1,04 millones de fatalidades. Aunque se sepa de experiencia anterior con SARS-CoV-1 y el síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS) que los coronaviruses son altamente virulentos, todavía no hay vacuna o droga aprobada por la FDA para ningún coronavirus.

Puesto que SARS-CoV-2 está estrechamente vinculado a los coronaviruses de SARS-CoV-1 y de MERS, se clasifica como agentes selectos del grupo de riesgo 3, que significa que el uso de los virus vivos está restringido a las instalaciones del nivel 3 de la seguridad biológica (BSL-3). Esto hace la investigación SARS-CoV-2 inaccesible a la mayoría de los laboratorios de investigación de funcionamiento en los E.E.U.U., inhibiendo un esfuerzo científico colectivo lamamientos de un ese tales pandémico para.

Crear los modelos BSL-2 para facilitar la investigación viral

El revelado de los modelos BSL-2 y los análisis virales compatibles es imprescindible facilitar el estudio del florecimiento y asiento viral y las aproximaciones terapéuticas potenciales. En el pasado, los modelos BSL-2 del otro BSL-3 altamente virulento y -4 patógeno, incluyendo SARS-CoV-1, MERS, el virus de Ebola, y el virus de Lassa, se han desarrollado bajo la forma de partículas de tipo virus (VLPs).

SARS-CoV-2, como otros coronaviruses, utiliza angiotensina-convertir la enzima 2 (ACE2), el receptor de la superficie de la célula humana, para habilitar la absorción celular de partículas virales. Las 4 proteínas estructurales del virus - clave (s), la membrana (m), el nucleocapsid (n), y el envolvente (e) - reputan responsables de mantener la integridad estructural del virion SARS-CoV-2.

En un papel reciente de la prueba preliminar publicado en el servidor del bioRxiv*, los investigadores del instituto de Purdue de la inflamación, la inmunología, y la enfermedad infecciosa, universidad de Purdue, Lafayette del oeste, HACIA ADENTRO, discuten sus esfuerzos de fijar las 4 proteínas estructurales SARS-CoV-2 para que su capacidad produzca VLPs de las células humanas para crear un sistema competente para los estudios BSL-2 de SARS-CoV-2. El estudio apuntó desarrollar VLPs que es morfológicamente y funcionalmente relevante que el estudio florecimiento y asiento de SARS-CoV-2 de la ayuda.

En su trabajo, las personas de investigadores ofrecen métodos y los recursos para la producción, purificación, y fluorescente y APEX2-labeling de SARS-CoV-2 VLPs, que puede ayudar a evaluar mecanismos virales del florecimiento y del asiento y el análisis de los inhibidores de la droga bajo condiciones BSL-2.

La microscopia electrónica de la exploración de la proteína estructural viral transfected las células. Las células HEK293 fueron sembradas sobre tiras y transfected individualmente o conjuntamente con M, repararon con aldehído glutárico 72 horas de poste-transfección y fueron guardados N, E, y/o a S. Cells en 4°C hasta que estuvo reparada con el tetróxido del osmio. Las muestras entonces fueron deshidratadas gradualmente con etanol y deshidratadas totalmente con un secante del punto crítico. Una vez que estuvieron deshidratadas, las muestras fueron montadas sobre las espigas de aluminio con la cinta de doble cara del carbono, encargada de la pintura de plata, y chisporrotean revestido antes de proyección de imagen. Las imágenes colocan en el aumento de 10,000x a 80,000x.
La microscopia electrónica de la exploración de la proteína estructural viral transfected las células. Las células HEK293 fueron sembradas sobre tiras y transfected individualmente o conjuntamente con M, repararon con aldehído glutárico 72 horas de poste-transfección y fueron guardados N, E, y/o a S. Cells en 4°C hasta que estuvo reparada con el tetróxido del osmio. Las muestras entonces fueron deshidratadas gradualmente con etanol y deshidratadas totalmente con un secante del punto crítico. Una vez que estuvieron deshidratadas, las muestras fueron montadas sobre las espigas de aluminio con la cinta de doble cara del carbono, encargada de la pintura de plata, y chisporrotean revestido antes de proyección de imagen. Las imágenes colocan en el aumento de 10,000x a 80,000x.

Un modelo realista del asiento viral SARS-CoV-2 disponible en la fijación BSL-2

A medida que el pandémico SARS-CoV-2 continúa rabiar conectado, es vital que más trabajo está hecho hacia perfeccionar nuestra comprensión fundamental de los mecanismos moleculares del virus. En este estudio, las personas analizaban la capacidad de las proteínas estructurales SARS-CoV-2 de formar VLPs y de encontrar que la proteína de M solamente no era suficiente para la formación de VLP, pero la co-expresión de M con las proteínas de N o de S era esencial para formar VLPs. También encontraron que la proteína de E tiene un efecto aditivo en la incorporación de N en VLPs así como en la producción de VLP, que destaca los juegos del papel dominante E en el montaje y la baja del virus.

Según los autores, sus conclusión presentan a nuevo SARS-CoV-2 el modelo de asiento viral en una fijación BSL-2: SARS-CoV-2 GFP- y APEX2-VLPs. Según datos vivos del virus, GFP-VLPs colocalize con Rab5, el marcador endosome temprano, y LAMP1, el último marcador endosome.

“En este trabajo, también presentamos por primera vez un modelo realista del asiento viral SARS-CoV-2 disponible en una fijación BSL-2: SARS-CoV-2 GFP- y APEX2-VLPs. De acuerdo con datos vivos del virus, GFP-VLPs colocalize con el marcador endosome temprano, Rab5, y el último marcador endosome, LAMP1.”

Las personas proyectan centrarse su trabajo futuro en la miniaturización de su análisis del asiento de GFP-VLP y utilizarlo en la investigación de los inhibidores virales de la absorción y del asiento.  Aparte de usar microscopia confocal para evaluar acciones del asiento de GFP-VLP, también utilizaron el ÁPICE que marcaba tecnología con etiqueta para permitir utilizar la microscopia electrónica para la evaluación del asiento SARS-CoV-2.

Las aproximaciones tradicionales a demostrar VLP-como las estructuras usando TEM basan su identificación solamente en morfología. Usando el ÁPICE que marcaba con etiqueta, las personas podían mostrar la localización de la proteína de S durante el montaje de VLP y florecimiento y también la formación y la exportación del Ápice-VLPs del lumen de ERGIC.

“En total, esta investigación ofrece los recursos suficientes para otros laboratorios BSL-2 interesados en ensamblar el campo cada vez mayor para intentar y para entender el montaje SARS-CoV-2, el florecimiento, y la dinámica del asiento, preguntas bioquímicas y biofísicas sobre las cuatro proteínas estructurales, y la investigación de la droga del montaje, del florecimiento, o de inhibidores virales del asiento.”

Advertencia *Important

el bioRxiv publica los partes científicos preliminares que par-no se revisan y, por lo tanto, no se deben mirar como concluyentes, conduce práctica clínica/comportamiento relativo a la salud, o tratado como información establecida.

Journal reference:
Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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