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Production de masse de protéine de SARS-CoV-2 ORF8 utilisant un système produit chimique-inductible en cellules du tabac BY-2

La maladie 2019 (COVID-19) de coronavirus est provoquée par le coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de syndrôme respiratoire aigu sévère, qui a apparu à Wuhan, la Chine, fin 2019 et a écarté mondial, entraînant une pandémie des proportions sans précédent. Jusqu'ici, la pandémie a affecté plus de 200 pays, avec 36,44 millions de cas confirmés et plus de 1,06 millions de morts mondial.

Vu la crise de santé globale que la pandémie a entraînée, les scientifiques mondiaux luttent pour trouver un vaccin ou un médicament pour lutter contre le virus SASR-CoV-2. Selon des études cliniques, la protéine ORF8 du virus SARS-CoV-2 a été montrée pour être associée aux sympt40mes COVID-19 sévères. Cependant, pas beaucoup est connu au sujet du fonctionnement exact de la protéine ORF8.

Que connaissons-nous la protéine de SARS-CoV-2 ORF8 ?

Les études ont prouvé que la protéine de SARS-CoV-2 ORF8 montre l'homologie élevée avec ORF8 des coronavirus de "bat". Les virus du mutant SARS-CoV-2 qui manquent de la protéine ORF8 étaient rapportés pour être moins pour entraîner la maladie sévère. La protéine ORF8 est dite hautement immunogène, et les anticorps anti-ORF8 sont produits dans le stade précoce de l'infection COVID-19. En outre, on a observé la réaction à cellule T significative à ORF8 dans les patients COVID-19 récupérés. Ainsi, ORF8 est dit attentivement joint aux sympt40mes provoqués par le virus SARS-CoV-2.

Les études de cristallisation de rayon X ont montré la structure 3D d'ORF8 et que la protéine affecte le système immunitaire humain. Afin de faire une analyse fonctionnelle d'ORF8, il est essentiel de fabriquer en série la protéine ORF8 avec la structure 3D correcte.

La production à grande échelle de la protéine ORF8 est-elle possible ?

Les chercheurs du Japon ont avancé l'institut de la science et technologie (JAIST) et de l'université préfectorale d'Ishikawa, Japon, récent essayé pour synthétiser la protéine ORF8 avec l'aide d'un système de production produit chimique-inductible de protéine utilisant des cellules du tabac BY-2. Cette étude a été publiée expliquée dans le serveur de prétirage, bioRxiv.*

L'équipe de recherche a produit d'une ligne d'ORF8-producing suivre la méthode d'agrobactérie et a produit 8,8 mg du ± 1,4 d'ORF8 par L du milieu de culture. Utilisant l'électrophorèse en gel dodécylique de sulfate-polyacrylamide de sodium (SDS-PAGE) et l'analyse (NMR) de résonance magnétique nucléaire, ils ont confirmé que la protéine ORF8 qu'ils ont produite en cellules du tabac BY-2 est sous sa forme dimère avec une structure 3D, à la différence de cela produit dans Escherichia coli (Escherichia coli). Supplémentaire, l'ORF8 produit utilisant ce système était N-glycosylé.

ORF8 a produit avec sa structure 3D intacte peut aider dans l'analyse fonctionnelle et la mise au point de vaccin

Dans cette étude, l'équipe a produit structurellement la protéine ORF8 intacte dans un tobamovirus (ToMV) - système de production assisté. Les auteurs disent que la purification d'ORF8 pourrait être simplifiée en déchargeant la protéine dans le milieu de culture qui a les contaminants centrale-dérivés très peu. Selon les auteurs, l'avantage d'employer des centrales pour la production de protéine est que le risque de contamination avec des endotoxines ou les agents pathogènes est zéro comparé à la production de protéine utilisant d'autres organismes tels qu'Escherichia coli.

« L'avantage de la production de protéine utilisant des centrales est qu'il n'y a aucun risque de contamination avec des endotoxines et les agents pathogènes comparés à la production utilisant d'autres organismes. »

Les découvertes de l'étude montrent qu'il est possible de fabriquer en série la protéine ORF8 structurelle avec la haute performance. Puisque l'ORF8 produit a eu la structure 3D intacte, il peut être employé dans l'analyse fonctionnelle et la production des anticorps et des vaccins qui visent la protéine de SARS-CoV-2 ORF8 dans les personnes infectées.

Selon les auteurs, le système qu'elles ont développé employant des cellules du tabac BY-2 est un système de production produit chimique-inductible très efficace de protéine. Elles ont utilisé la capacité de production très à haute valeur protéique de ToMV. Les chercheurs prétendent que leur travail a aidé le produit ORF8 avec la structure 3D correcte utilisant un système de production efficace en cellules du tabac BY2. Ils espèrent que l'ORF8 produit par eux avancera l'analyse fonctionnelle d'ORF8 et aidera le développement des anticorps et des vaccins contre la protéine ORF8.

« ORF8 mature a sept cystéines, six dont les paires intramoléculaires de bisulfure-obligation de la forme trois et une forme une bisulfure-obligation intermoléculaire pour la dimérisation. De plus, un site de N-glycosylation est prévu pour ORF8. On s'attend à ce que notre système de production convienne pour la production uniforme de la protéine ORF8 avec ces configurations structurelles. »

Production et caractérisation d
Production et caractérisation d'ORF8. (a) Représentations schématiques du génome SARS-CoV-2. E, M, et N indiquent la protéine d'enveloppe, la glycoprotéine de membrane, et la phosphoprotéine de nucleocapsid, respectivement. (b) Synthèse schématique du l'expression-système ToMV-assisté produit chimique-inductible. Étape 1 : Expression constitutive de XVE, un activateur transcriptionnel. Étape 2 : XVE grippe à l'oestradiol et obtient activé. Étape 3 : XVE activé grippe au promoteur OLexA-46 ou aux livres pour introduire la transcription de transgène. Étape 4 : Des séquences non virales qui nuisent la réplication du vecteur viral sont retirées par des ribozymes. Étape 5 : Réplication virale de vecteur. Étape 6 : Traduction d'ORF8 d'ARN subgenomic. Étape 7 : Translocation d'ORF8. (c) Séquence des acides aminés d'ORF8. Les lettres bleues et rouges indiquent le peptide signal et le site de N-glycosylation, respectivement. Les soulignés indiquent la cystéine. (d) Représentations schématiques des plasmides produit chimique-induits ToMV-assistés d'expression. XVE, activateur transcriptionnel qui répond à l'oestrogène ; SP, peptide signal de chitinase d'Arabidopsis ; 8 sien, Son-balise 8× ; Livres, accepteur de LexA ; PG10-90, promoteur constitutif synthétique ; PLexA-46, promoteur de fusion réglé par XVE ; dMP, protéine partielle de mouvement ; SRz, séquence de ribozyme des ARNS satellites de virus de tache annulaire de tabac ; 35ST, terminateur 35S ; RB, bonne bordure ; et livre, bordure gauche. Hygr et Kanr indiquent le magasin d'expression de gènes de résistance de hygromycin et de kanamycine, respectivement. (e) Rétablissement de lignée cellulaire d'ORF8-producing et admission de la production ORF8. (f) Quatre jours après l'admission 17β-estradiol des cellules suspension-cultivées du tabac BY-2 ; + et − indiquez avec ou sans 17β-estradiol, respectivement. Le dépistage de (G) d'ORF8 du µL 7,5 a cultivé le support par la souillure bleue brillante de Coomassie. + et − indiquez avec ou sans 17β-estradiol, respectivement. La pointe de flèche indique ORF8. Le lysozyme (5 mg/L) indique le contrôle de charge. (h) ORF8 Non-épuré et épuré. Le PC et le CM indiquent les extraits bruts des cellules et du milieu de culture de centrale, respectivement. (i) Propriété moléculaire d'ORF8. + et − indiquez avec ou sans le mercaptoéthanol 2 (2ME), respectivement. M, borne de capacité protéique. Les numéros indiquent des poids moléculaires (kDa). (j) 1 spectres rmn de H d'ORF8 non étiqueté. La ligne rouge indique la région apparaissante de signe glycan. (k) 1 H-13C HSQC de la protéine ORF8 non étiquetée. Une vue augmentée de la région apparaissante de signe glycan est montrée. (l) 1 H-15N HSQC de 15N-labeled ORF8.

Avis *Important

le bioRxiv publie les états scientifiques préliminaires qui pair-ne sont pas observés et ne devraient pas, en conséquence, être considérés comme concluants, guident la pratique clinique/comportement relatif à la santé, ou traité en tant qu'information déterminée.

Journal reference:
Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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