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Fabbricazione in serie della proteina di SARS-CoV-2 ORF8 facendo uso di un sistema prodotto-viscoelastico in celle del tabacco BY-2

La malattia 2019 (COVID-19) di Coronavirus è causata dal coronavirus 2 (SARS-CoV-2) di sindrome respiratorio acuto severo, che è emerso a Wuhan, la Cina, alla fine del 2019 e si è sparsa universalmente, causando una pandemia delle proporzioni senza precedenti. Finora, la pandemia ha pregiudicato oltre 200 paesi, con 36,44 milione casi confermati ed oltre 1,06 milione infortuni mortali globalmente.

Dato alla crisi di salubrità globale la pandemia ha causato, gli scienziati universalmente stanno lottando per trovare un vaccino o una droga per combattere contro il virus SASR-CoV-2. Secondo gli studi clinici, la proteina ORF8 del virus SARS-CoV-2 è stata indicata per essere associata con i sintomi severi COVID-19. Tuttavia, non molto è conosciuto circa la funzione esatta della proteina ORF8.

Che cosa conosciamo circa la proteina di SARS-CoV-2 ORF8?

Gli studi hanno indicato che la proteina di SARS-CoV-2 ORF8 mostra l'alta omologia con ORF8 del coronavirus del pipistrello. I virus mutanti SARS-CoV-2 che mancano della proteina ORF8 sono stati riferiti per essere meno probabili causare la malattia severa. La proteina ORF8 sarebbe altamente immunogena e gli anticorpi anti-ORF8 sono prodotti nella fase iniziale di infezione COVID-19. Inoltre, la risposta a cellula T significativa a ORF8 è stata osservata in pazienti recuperati COVID-19. Quindi, ORF8 sarebbe collegato molto attentamente ai sintomi causati dal virus SARS-CoV-2.

Gli studi di cristallizzazione dei raggi x hanno indicato la struttura 3D di ORF8 e che la proteina pregiudica il sistema immunitario umano. Per fare un'analisi funzionale di ORF8, è essenziale per produr in seriee la proteina ORF8 con la struttura corretta 3D.

È la produzione su grande scala della proteina ORF8 possibile?

I ricercatori dal Giappone hanno avanzato l'istituto di scienza e tecnologia (JAIST) e dell'università di prefettura di Ishikawa, Giappone, recentemente tentato per sintetizzare la proteina ORF8 con l'aiuto di un sistema di produzione prodotto-viscoelastico della proteina facendo uso delle celle del tabacco BY-2. Questo studio è stato pubblicato ha dimostrato nel " server " della pubblicazione preliminare, bioRxiv.*

Il gruppo dei ricercatori ha generato una riga di ORF8-producing facendo uso del metodo dell'agrobatterio ed ha prodotto 8,8 mg del ± 1,4 di ORF8 per L del terreno di coltura. Facendo uso dell'elettroforesi dodecilica del gel del solfato-poliacrilammide del sodio (SDS-PAGE) e dell'analisi a risonanza magnetica (NMR) nucleare, hanno confermato che la proteina che ORF8 hanno prodotto in celle del tabacco BY-2 è nel suo modulo dimero con una struttura 3D, a differenza di quello prodotto in Escherichia coli (Escherichia coli). Ulteriormente, il ORF8 prodotto facendo uso di questo sistema era N-glicosilato.

ORF8 ha prodotto con la sua struttura 3D intatta può aiutare nell'analisi funzionale e nello sviluppo del vaccino

In questo studio, il gruppo ORF8 proteina intatta strutturalmente prodotta in un tobamovirus (ToMV) - sistema di produzione mediato. Gli autori dicono che la depurazione di ORF8 potrebbe essere semplificata scaricando la proteina nel terreno di coltura che ha agenti inquinanti impianto-derivati pochissimi. Secondo gli autori, il vantaggio di usando gli impianti per la produzione della proteina è che il rischio di contaminazione con le endotossine o gli agenti patogeni è zero confrontato a produzione della proteina facendo uso di altri organismi quale Escherichia coli.

“Il vantaggio di produzione della proteina facendo uso degli impianti è che non c'è rischio di contaminazione con le endotossine e gli agenti patogeni confrontati a produzione facendo uso di altri organismi.„

I risultati dello studio provano che è possibile produr in seriee la proteina strutturale ORF8 con alta efficienza. Poiché il ORF8 prodotto ha avuto la struttura 3D intatta, può essere utilizzato nell'analisi funzionale e nella produzione degli anticorpi e dei vaccini che mirano alla proteina di SARS-CoV-2 ORF8 in persone infettate.

Secondo gli autori, il sistema che hanno messo a punto usando le celle del tabacco BY-2 è un sistema di produzione prodotto-viscoelastico molto efficiente della proteina. Hanno utilizzato la capacità di produzione molto ad alta percentuale proteica di ToMV. I ricercatori sostengono che il loro lavoro ha aiutato i prodotti ORF8 con la struttura corretta 3D facendo uso di un sistema di produzione efficiente in celle del tabacco BY2. Sperano che il ORF8 prodotto da loro avanzi l'analisi funzionale di ORF8 ed aiuti lo sviluppo degli anticorpi e dei vaccini contro la proteina ORF8.

“ORF8 maturo ha sette cisteine, sei cui delle paia intramolecolari dell'bisolfuro-obbligazione dei moduli tre ed uno forma un'bisolfuro-obbligazione intermolecolare per la dimerizzazione. Inoltre, un sito della N-glicosilazione è preveduto per ORF8. Il nostro sistema di produzione si pensa che sia adatto a produzione costante della proteina ORF8 con queste funzionalità strutturali.„

Produzione e caratterizzazione di ORF8.
Produzione e caratterizzazione di ORF8. (a) Rappresentazioni schematiche del genoma SARS-CoV-2. La E, la m. e N indicano la proteina di rivestimento, la glicoproteina della membrana e la fosfoproteina del nucleocapsid, rispettivamente. (b) generalità schematica del espressione-sistema ToMV-mediato prodotto-viscoelastico. Punto 1: Espressione costitutiva di XVE, un attivatore trascrizionale. Punto 2: XVE lega all'estradiolo ed ottiene attivato. Punto 3: XVE attivato lega al promotore OLexA-46 o alle libbre per promuovere la trascrizione del transgene. Punto 4: le sequenze Non virali che interferiscono con la replica del vettore virale sono eliminate dai ribozimi. Punto 5: Replica virale di vettore. Punto 6: Traduzione di ORF8 da RNA subgenomic. Punto 7: Spostamento di ORF8. (c) sequenza aminoacidica di ORF8. Le lettere blu e rosse indicano il peptide di segnale ed il sito della N-glicosilazione, rispettivamente. I Underbars indicano la cisteina. (d) rappresentazioni schematiche dai dei plasmidi indotti da prodotto ToMV-mediati di espressione. XVE, attivatore trascrizionale che risponde ad estrogeno; SP, peptide di segnale del chitinase di Arabidopsis; 8 suo, Suo-tag 8×; Libbre, sede del legame di LexA; PG10-90, promotore costitutivo sintetico; PLexA-46, promotore di fusione gestito da XVE; dMP, proteina parziale del movimento; SRz, sequenza del ribozima dal RNA satellite del virus della maculatura anulare del tabacco; 35ST, terminatore 35S; RB, giusto confine; e libbra, confine sinistro. Hygr e Kanr indicano il caricatore 35mm di espressione dei geni di resistenza della kanamicina e di hygromycin, rispettivamente. (e) generazione di linea cellulare di ORF8-producing ed induzione di produzione ORF8. (f) quattro giorni dopo induzione 17β-estradiol delle celle sospensione-coltivate del tabacco BY-2; + e − indichi con o senza 17β-estradiol, rispettivamente. (g) la rilevazione di ORF8 da µL 7,5 ha coltivato il media dalla macchiatura blu brillante di Coomassie. + e − indichi con o senza 17β-estradiol, rispettivamente. La sagittaria indica ORF8. Il lisozima (5 mg/l) indica il controllo di caricamento. (h) ORF8 Non depurativo e depurativo. Il PC ed il cm indicano gli estratti grezzi di cellule vegetali e di terreno di coltura, rispettivamente. (i) Beni molecolari di ORF8. + e − indichi con o senza 2 mercaptoetanolo (2ME), rispettivamente. M., indicatore di dimensione della proteina. I numeri indicano i pesi molecolari (kDa). (j) 1 spettri RMN di H di ORF8 adenoide. La linea rossa indica la regione comparente del segnale glycan. (k) 1 H-13C HSQC di proteina adenoida ORF8. Una visualizzazione ampliata della regione comparente del segnale glycan è indicata. (l) 1 H-15N HSQC di 15N-labeled ORF8.

Avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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