A doença 2019 de Coronavirus (COVID-19) é causada pelo coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2), que emergiu em Wuhan, China, ao fim de 2019 e espalhada no mundo inteiro, causando uma pandemia de proporções inauditas. Até agora, a pandemia afectou sobre 200 países, com 36,44 milhão casos confirmados e sobre 1,06 milhão fatalidades global.
Dado a crise de saúde global a pandemia causou, os cientistas no mundo inteiro estão esforçando-se para encontrar uma vacina ou uma droga para lutar contra o vírus SASR-CoV-2. De acordo com estudos clínicos, a proteína ORF8 do vírus SARS-CoV-2 foi mostrada para ser associada com os sintomas COVID-19 severos. Contudo, não muito é sabido sobre a função exacta da proteína ORF8.
Que nós sabemos sobre a proteína de SARS-CoV-2 ORF8?
Os estudos mostraram que a proteína de SARS-CoV-2 ORF8 mostra a homologia alta com o ORF8 do coronavirus do bastão. Os vírus do mutante SARS-CoV-2 que faltam a proteína ORF8 foram relatados para ser menos prováveis causar a doença severa. A proteína ORF8 seriam altamente imunogenética, e os anticorpos anti-ORF8 são produzidos na fase inicial da infecção COVID-19. Também, a resposta de célula T significativa a ORF8 foi observada nos pacientes COVID-19 recuperados. Assim, ORF8 seriam ligado pròxima aos sintomas causados pelo vírus SARS-CoV-2.
Os estudos da cristalização do raio X mostraram a estrutura 3D de ORF8 e que a proteína afecta o sistema imunitário humano. A fim fazer uma análise funcional de ORF8, é essencial produzir em massa a proteína ORF8 com a estrutura 3D correcta.
É a produção em grande escala da proteína ORF8 possível?
Os pesquisadores do Japão avançaram o instituto da ciência e da tecnologia (JAIST) e a universidade prefeitural de Ishikawa, Japão, tentado recentemente sintetizar a proteína ORF8 com a ajuda de um sistema de produção produto-inducible da proteína usando pilhas do tabaco BY-2. Este estudo foi publicado demonstrou no server da pré-impressão, bioRxiv.*
A equipe dos pesquisadores gerou uma linha de ORF8-producing usando o método da agrobactéria e produziu 8,8 o magnésio do ± 1,4 de ORF8 por L do media de cultura. Usando a electroforese dodecyl do gel do sulfato-polyacrylamide do sódio (SDS-PAGE) e a análise da ressonância magnética (NMR) nuclear, confirmaram que a proteína que ORF8 produziram em pilhas do tabaco BY-2 está em seu formulário dimeric com uma estrutura 3D, ao contrário daquele produzido em Escherichia Coli (Escherichia Coli). Adicionalmente, o ORF8 produzido usando este sistema era N-glycosylated.
ORF8 produziu com sua estrutura 3D intacto pode ajudar na análise funcional e na revelação vacinal
Neste estudo, a equipe proteína ORF8 intacto estrutural produzida em um tobamovirus (ToMV) - sistema de produção negociado. Os autores dizem que a purificação de ORF8 poderia ser simplificada liberando a proteína no media de cultura que tem contaminadores planta-derivados muito pequenos. De acordo com os autores, a vantagem de usar plantas para a produção da proteína é que o risco de contaminação com endotoxinas ou micróbios patogénicos é nada comparado à produção da proteína usando outros organismos tais como Escherichia Coli.
“A vantagem da produção da proteína que usa plantas é que não há nenhum risco de contaminação com as endotoxinas e os micróbios patogénicos comparados à produção usando outros organismos.”
Os resultados do estudo mostram que é possível produzir em massa a proteína ORF8 estrutural com eficiência elevada. Desde que o ORF8 produzido teve a estrutura 3D intacto, pode ser usado na análise funcional e na produção de anticorpos e de vacinas que visam a proteína de SARS-CoV-2 ORF8 em indivíduos contaminados.
De acordo com os autores, o sistema que desenvolveram usando pilhas do tabaco BY-2 é um sistema de produção produto-inducible muito eficiente da proteína. Utilizaram o muito alto - capacidade de produção da proteína de ToMV. Os pesquisadores reivindicam que seu trabalho ajudou o produto ORF8 com a estrutura 3D correcta usando um sistema de produção eficiente em pilhas do tabaco BY2. Esperam que o ORF8 produzido por eles avançará a análise funcional de ORF8 e ajudará a revelação dos anticorpos e das vacinas contra a proteína ORF8.
“ORF8 maduro tem sete cysteines, seis de que os pares intramolecular da bissulfeto-ligação do formulário três e um formam uma bissulfeto-ligação intermolecular para o dimerization. Além, um local do N-glycosylation é previsto para ORF8. Nosso sistema de produção é esperado ser apropriado para a produção uniforme da proteína ORF8 com estas características estruturais.”
Produção e caracterização de ORF8. (a) Representações esquemáticas do genoma SARS-CoV-2. E, M, e N indicam a proteína de envelope, a glicoproteína da membrana, e o phosphoprotein do nucleocapsid, respectivamente. (b) Vista geral esquemática do expressão-sistema ToMV-negociado produto-inducible. Etapa 1: Expressão constitutiva de XVE, um activador transcricional. Etapa 2: XVE liga ao estradiol e obtem ativado. Etapa 3: XVE ativado liga ao promotor OLexA-46 ou às libras para promover a transcrição do transgene. Etapa 4: as seqüências Não-virais que interferem com a réplica do vector viral são removidas por ribozymes. Etapa 5: Réplica viral do vector. Etapa 6: Tradução de ORF8 do RNA subgenomic. Etapa 7: Translocação de ORF8. (c) Seqüência de ácido aminado de ORF8. As letras azuis e vermelhas indicam o peptide de sinal e o local do N-glycosylation, respectivamente. Os Underbars indicam o cysteine. (d) Representações esquemáticas de plasmídeo produto-induzidos ToMV-negociados da expressão. XVE, activador transcricional que responde à hormona estrogénica; SP, peptide de sinal do chitinase de Arabidopsis; 8 seu, Seu-etiqueta 8×; Libras, local obrigatório de LexA; PG10-90, promotor constitutivo sintético; PLexA-46, promotor da fusão controlado por XVE; dMP, proteína parcial do movimento; SRz, seqüência do ribozyme do RNA satélite do vírus da mancha digital do tabaco; 35ST, terminal 35S; RB, beira direita; e libra, beira esquerda. Hygr e Kanr indicam a gaveta da expressão de genes de resistência do hygromycin e do kanamycin, respectivamente. (e) Geração de linha celular de ORF8-producing e indução da produção ORF8. (f) Quatro dias após a indução 17β-estradiol de pilhas suspensão-cultivadas do tabaco BY-2; + e − indique com ou sem 17β-estradiol, respectivamente. (g) A detecção de ORF8 do µL 7,5 cultivou o media pela mancha azul brilhante de Coomassie. + e − indique com ou sem 17β-estradiol, respectivamente. A seta indica ORF8. Lysozyme (5 mg/L) indicam o controle de carga. (h) ORF8 Não-refinado e refinado. O PC e o CM indicam extractos brutos de pilhas da planta e de media de cultura, respectivamente. (i) Propriedade molecular de ORF8. + e − indique com ou sem o mercaptoethanol 2 (2ME), respectivamente. M, marcador do tamanho da proteína. Os números indicam peso moleculares (kDa). (j) 1 espectros NMR de H de ORF8 sem etiqueta. A linha vermelha indica a região aparecendo do sinal glycan. (k) 1 H-13C HSQC da proteína ORF8 sem etiqueta. Uma ideia expandida da região aparecendo do sinal glycan é mostrada. (l) 1 H-15N HSQC de 15N-labeled ORF8.
Observação *Important
o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.