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Produção em massa de proteína de SARS-CoV-2 ORF8 usando um sistema produto-inducible em pilhas do tabaco BY-2

A doença 2019 de Coronavirus (COVID-19) é causada pelo coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2), que emergiu em Wuhan, China, ao fim de 2019 e espalhada no mundo inteiro, causando uma pandemia de proporções inauditas. Até agora, a pandemia afectou sobre 200 países, com 36,44 milhão casos confirmados e sobre 1,06 milhão fatalidades global.

Dado a crise de saúde global a pandemia causou, os cientistas no mundo inteiro estão esforçando-se para encontrar uma vacina ou uma droga para lutar contra o vírus SASR-CoV-2. De acordo com estudos clínicos, a proteína ORF8 do vírus SARS-CoV-2 foi mostrada para ser associada com os sintomas COVID-19 severos. Contudo, não muito é sabido sobre a função exacta da proteína ORF8.

Que nós sabemos sobre a proteína de SARS-CoV-2 ORF8?

Os estudos mostraram que a proteína de SARS-CoV-2 ORF8 mostra a homologia alta com o ORF8 do coronavirus do bastão. Os vírus do mutante SARS-CoV-2 que faltam a proteína ORF8 foram relatados para ser menos prováveis causar a doença severa. A proteína ORF8 seriam altamente imunogenética, e os anticorpos anti-ORF8 são produzidos na fase inicial da infecção COVID-19. Também, a resposta de célula T significativa a ORF8 foi observada nos pacientes COVID-19 recuperados. Assim, ORF8 seriam ligado pròxima aos sintomas causados pelo vírus SARS-CoV-2.

Os estudos da cristalização do raio X mostraram a estrutura 3D de ORF8 e que a proteína afecta o sistema imunitário humano. A fim fazer uma análise funcional de ORF8, é essencial produzir em massa a proteína ORF8 com a estrutura 3D correcta.

É a produção em grande escala da proteína ORF8 possível?

Os pesquisadores do Japão avançaram o instituto da ciência e da tecnologia (JAIST) e a universidade prefeitural de Ishikawa, Japão, tentado recentemente sintetizar a proteína ORF8 com a ajuda de um sistema de produção produto-inducible da proteína usando pilhas do tabaco BY-2. Este estudo foi publicado demonstrou no server da pré-impressão, bioRxiv.*

A equipe dos pesquisadores gerou uma linha de ORF8-producing usando o método da agrobactéria e produziu 8,8 o magnésio do ± 1,4 de ORF8 por L do media de cultura. Usando a electroforese dodecyl do gel do sulfato-polyacrylamide do sódio (SDS-PAGE) e a análise da ressonância magnética (NMR) nuclear, confirmaram que a proteína que ORF8 produziram em pilhas do tabaco BY-2 está em seu formulário dimeric com uma estrutura 3D, ao contrário daquele produzido em Escherichia Coli (Escherichia Coli). Adicionalmente, o ORF8 produzido usando este sistema era N-glycosylated.

ORF8 produziu com sua estrutura 3D intacto pode ajudar na análise funcional e na revelação vacinal

Neste estudo, a equipe proteína ORF8 intacto estrutural produzida em um tobamovirus (ToMV) - sistema de produção negociado. Os autores dizem que a purificação de ORF8 poderia ser simplificada liberando a proteína no media de cultura que tem contaminadores planta-derivados muito pequenos. De acordo com os autores, a vantagem de usar plantas para a produção da proteína é que o risco de contaminação com endotoxinas ou micróbios patogénicos é nada comparado à produção da proteína usando outros organismos tais como Escherichia Coli.

“A vantagem da produção da proteína que usa plantas é que não há nenhum risco de contaminação com as endotoxinas e os micróbios patogénicos comparados à produção usando outros organismos.”

Os resultados do estudo mostram que é possível produzir em massa a proteína ORF8 estrutural com eficiência elevada. Desde que o ORF8 produzido teve a estrutura 3D intacto, pode ser usado na análise funcional e na produção de anticorpos e de vacinas que visam a proteína de SARS-CoV-2 ORF8 em indivíduos contaminados.

De acordo com os autores, o sistema que desenvolveram usando pilhas do tabaco BY-2 é um sistema de produção produto-inducible muito eficiente da proteína. Utilizaram o muito alto - capacidade de produção da proteína de ToMV. Os pesquisadores reivindicam que seu trabalho ajudou o produto ORF8 com a estrutura 3D correcta usando um sistema de produção eficiente em pilhas do tabaco BY2. Esperam que o ORF8 produzido por eles avançará a análise funcional de ORF8 e ajudará a revelação dos anticorpos e das vacinas contra a proteína ORF8.

“ORF8 maduro tem sete cysteines, seis de que os pares intramolecular da bissulfeto-ligação do formulário três e um formam uma bissulfeto-ligação intermolecular para o dimerization. Além, um local do N-glycosylation é previsto para ORF8. Nosso sistema de produção é esperado ser apropriado para a produção uniforme da proteína ORF8 com estas características estruturais.”

Produção e caracterização de ORF8.
Produção e caracterização de ORF8. (a) Representações esquemáticas do genoma SARS-CoV-2. E, M, e N indicam a proteína de envelope, a glicoproteína da membrana, e o phosphoprotein do nucleocapsid, respectivamente. (b) Vista geral esquemática do expressão-sistema ToMV-negociado produto-inducible. Etapa 1: Expressão constitutiva de XVE, um activador transcricional. Etapa 2: XVE liga ao estradiol e obtem ativado. Etapa 3: XVE ativado liga ao promotor OLexA-46 ou às libras para promover a transcrição do transgene. Etapa 4: as seqüências Não-virais que interferem com a réplica do vector viral são removidas por ribozymes. Etapa 5: Réplica viral do vector. Etapa 6: Tradução de ORF8 do RNA subgenomic. Etapa 7: Translocação de ORF8. (c) Seqüência de ácido aminado de ORF8. As letras azuis e vermelhas indicam o peptide de sinal e o local do N-glycosylation, respectivamente. Os Underbars indicam o cysteine. (d) Representações esquemáticas de plasmídeo produto-induzidos ToMV-negociados da expressão. XVE, activador transcricional que responde à hormona estrogénica; SP, peptide de sinal do chitinase de Arabidopsis; 8 seu, Seu-etiqueta 8×; Libras, local obrigatório de LexA; PG10-90, promotor constitutivo sintético; PLexA-46, promotor da fusão controlado por XVE; dMP, proteína parcial do movimento; SRz, seqüência do ribozyme do RNA satélite do vírus da mancha digital do tabaco; 35ST, terminal 35S; RB, beira direita; e libra, beira esquerda. Hygr e Kanr indicam a gaveta da expressão de genes de resistência do hygromycin e do kanamycin, respectivamente. (e) Geração de linha celular de ORF8-producing e indução da produção ORF8. (f) Quatro dias após a indução 17β-estradiol de pilhas suspensão-cultivadas do tabaco BY-2; + e − indique com ou sem 17β-estradiol, respectivamente. (g) A detecção de ORF8 do µL 7,5 cultivou o media pela mancha azul brilhante de Coomassie. + e − indique com ou sem 17β-estradiol, respectivamente. A seta indica ORF8. Lysozyme (5 mg/L) indicam o controle de carga. (h) ORF8 Não-refinado e refinado. O PC e o CM indicam extractos brutos de pilhas da planta e de media de cultura, respectivamente. (i) Propriedade molecular de ORF8. + e − indique com ou sem o mercaptoethanol 2 (2ME), respectivamente. M, marcador do tamanho da proteína. Os números indicam peso moleculares (kDa). (j) 1 espectros NMR de H de ORF8 sem etiqueta. A linha vermelha indica a região aparecendo do sinal glycan. (k) 1 H-13C HSQC da proteína ORF8 sem etiqueta. Uma ideia expandida da região aparecendo do sinal glycan é mostrada. (l) 1 H-15N HSQC de 15N-labeled ORF8.

Observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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