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Producción en masa de la proteína de SARS-CoV-2 ORF8 usando un sistema substancia-inducible en células del tabaco BY-2

La enfermedad 2019 (COVID-19) de Coronavirus es causada por el coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de la neumonía asiática, que emergió en Wuhan, China, a finales de 2019 y se extendió por todo el mundo, causando un pandémico de proporciones sin precedentes. Hasta ahora, el pandémico ha afectado sobre 200 países, con 36,44 millones de casos confirmados y sobre 1,06 millones de fatalidades global.

Dado la crisis de salud global el pandémico ha causado, los científicos por todo el mundo están luchando para encontrar una vacuna o una droga para luchar contra el virus SASR-CoV-2. Según estudios clínicos, la proteína ORF8 del virus SARS-CoV-2 se ha mostrado para ser asociada a los síntomas severos COVID-19. Sin embargo, no mucho se sabe sobre la función exacta de la proteína ORF8.

¿Qué sabemos sobre la proteína de SARS-CoV-2 ORF8?

Los estudios han mostrado que la proteína de SARS-CoV-2 ORF8 muestra la alta homología con ORF8 del coronavirus del palo. Los virus del mutante SARS-CoV-2 que faltan la proteína ORF8 fueron denunciados para ser menos probables causar enfermedad severa. La proteína ORF8 reputa altamente inmunogenética, y los anticuerpos anti-ORF8 se producen en el primero tiempo de la infección COVID-19. También, la reacción importante del linfocito T a ORF8 se ha observado en los pacientes recuperados COVID-19. Así, ORF8 reputa conectado de cerca a los síntomas causados por el virus SARS-CoV-2.

Los estudios de la cristalización de la radiografía han mostrado la estructura 3D de ORF8 y que la proteína afecta al sistema inmune humano. Para hacer un análisis funcional de ORF8, es esencial producir en masa la proteína ORF8 con la estructura correcta 3D.

¿Es la producción en grande de la proteína ORF8 posible?

Los investigadores del Japón avance el instituto de la ciencia y de la tecnología (JAIST) y la universidad de la prefectura de Ishikawa, Japón, tentativa recientemente para sintetizar la proteína ORF8 con la ayuda de un sistema de producción substancia-inducible de la proteína usando las células del tabaco BY-2. Se ha publicado este estudio demostró en el servidor de la prueba preliminar, bioRxiv.*

Las personas de investigadores generaron una línea de ORF8-producing usando el método de la agrobacteria y produjeron 8,8 el magnesio del ± 1,4 de ORF8 por L del medio de cultivo. Usando la electroforesis dodecyl del gel de la sulfato-poliacrilamida del sodio (SDS-PAGE) y el análisis de resonancia magnética (NMR) nuclear, confirmaron que la proteína ORF8 que produjeron en células del tabaco BY-2 está en su forma dimérica con una estructura 3D, a diferencia de eso producida en Escherichia Coli (Escherichia Coli). Además, el ORF8 producido usando este sistema era N-glycosylated.

ORF8 produjo con su estructura 3D intacto puede ayudar en análisis funcional y el revelado vaccíneo

En este estudio, las personas estructural producida proteína intacta ORF8 en un tobamovirus (ToMV) - sistema de producción mediado. Los autores dicen que la purificación de ORF8 podría ser simplificada liberando la proteína en el medio de cultivo que tiene contaminantes instalación-derivados muy pequeños. Según los autores, la ventaja de usar las instalaciones para la producción de la proteína es que el riesgo de contaminación con las endotoxinas o los patógeno es nada comparada a la producción de la proteína usando otros organismos tales como Escherichia Coli.

“La ventaja de la producción de la proteína usando las instalaciones es que no hay riesgo de contaminación con las endotoxinas y los patógeno comparados a la producción usando otros organismos.”

Las conclusión del estudio prueban que es posible producir en masa la proteína estructural ORF8 con eficacia alta. Puesto que el ORF8 producido tenía la estructura 3D intacto, puede ser utilizado en análisis funcional y la producción de anticuerpos y de vacunas que apunten la proteína de SARS-CoV-2 ORF8 en individuos infectados.

Según los autores, el sistema que han desarrollado usando las células del tabaco BY-2 es un sistema de producción substancia-inducible muy eficiente de la proteína. Han utilizado la capacidad de producción muy de alto valor proteico de ToMV. Los investigadores demandan que su trabajo ayudó a la producción ORF8 con la estructura correcta 3D usando un sistema de producción eficiente en células del tabaco BY2. Esperan que el ORF8 producido por ellos avance el análisis funcional de ORF8 y ayude al revelado de anticuerpos y de vacunas contra la proteína ORF8.

“ORF8 maduro tiene siete cisteínas, seis cuyo los pares intramoleculares de la disulfuro-ligazón de la forma tres y una forman una disulfuro-ligazón intermolecular para la dimerización. Además, un sitio del N-glycosylation se predice para ORF8. Se prevee que nuestro sistema de producción sea conveniente para la producción uniforme de la proteína ORF8 con estas características estructurales.”

Producción y caracterización de ORF8.
Producción y caracterización de ORF8. (a) Representaciones esquemáticas del genoma SARS-CoV-2. E, M, y N indican la proteína de envolvente, la glicoproteína de la membrana, y la fosfoproteína del nucleocapsid, respectivamente. (b) Reseña esquemática del expresión-sistema ToMV-mediado substancia-inducible. Paso 1: Expresión constitutiva de XVE, un activador transcriptivo. Paso 2: XVE ata al estradiol y consigue activado. Paso 3: XVE activado ata al promotor OLexA-46 o a las libras para ascender la transcripción del transgén. Paso 4: las series No-virales que interfieren con la réplica del vector viral son quitadas por los ribozymes. Paso 5: Réplica viral del vector. Paso 6: Traslación de ORF8 del ARN subgenomic. Paso 7: Desplazamiento de ORF8. (c) Serie de aminoácido de ORF8. Las cartas azules y rojas indican el péptido de señal y el sitio del N-glycosylation, respectivamente. Los Underbars indican la cisteína. (d) Representaciones esquemáticas de los plásmidos substancia-inducidos ToMV-mediados de la expresión. XVE, activador transcriptivo que responde al estrógeno; SP, péptido de señal del chitinase de Arabidopsis; 8 el suyo, Su-etiqueta 8×; Libras, punto de enlace de LexA; PG10-90, promotor constitutivo sintetizado; PLexA-46, promotor de la fusión controlado por XVE; dMP, proteína parcial del movimiento; SRz, serie del ribozyme del ARN por satélite del virus del ringspot del tabaco; 35ST, adaptador 35S; RB, banda correcta; y libra, banda izquierda. Hygr y Kanr indican el magazín de la expresión de genes de resistencia del hygromycin y de la kanamicina, respectivamente. (e) Generación de variedad de células de ORF8-producing e inducción de la producción ORF8. (f) Cuatro días después de la inducción 17β-estradiol de las células suspensión-cultivadas del tabaco BY-2; + y − indique con o sin 17β-estradiol, respectivamente. La detección del (G) de ORF8 a partir del µL el 7,5 cultivó ambiente por la coloración azul brillante de Coomassie. + y − indique con o sin 17β-estradiol, respectivamente. La punta de flecha indica ORF8. La lisozima (5 mg/l) indica mando de cargamento. (h) ORF8 No-purificado y purificado. La PC y el cm indican los extractos crudos de células de la instalación y de medio de cultivo, respectivamente. (i) Propiedad molecular de ORF8. + y − indique con o sin el mercaptoetanol 2 (2ME), respectivamente. M, marcador de la talla de la proteína. Los números indican los pesos moleculares (kDa). (j) 1 espectros de Rmn de H de ORF8 sin etiqueta. La línea roja indica la región que aparece de la señal glycan. (k) 1 H-13C HSQC de la proteína sin etiqueta ORF8. Una vista desplegada de la región que aparece de la señal glycan se muestra. (l) 1 H-15N HSQC de 15N-labeled ORF8.

Advertencia *Important

el bioRxiv publica los partes científicos preliminares que par-no se revisan y, por lo tanto, no se deben mirar como concluyentes, conduce práctica clínica/comportamiento relativo a la salud, o tratado como información establecida.

Journal reference:
Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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