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représentation 3D de l'infection SARS-CoV-2 dans les furets utilisant la microscopie légère de feuille

Les chercheurs de Friedrich-Loeffler-Institut, institut de recherches fédéral pour des santés animales expliquent la capacité de trouver l'infection du coronavirus 2 de syndrôme respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2) dans les prélèvements de tissu 3D dans les furets. Ceci permettra le dépistage des configurations d'infection dans les tissus et leurs interdépendances.  La recherche est publiée sur le bioRxiv* de serveur de prétirage en octobre 2020.

Le virus SARS-CoV-2 entraînant la pandémie COVID-19 est un virus ARN monocatenaire. Le virus est pensé pour avoir été transmis des animaux, bien qu'il n'y ait aucune preuve pourtant de boîte de vitesses directe.

Indépendamment d'étudier le moléculaire et les mécanismes biologiques du viral infection sur des cellules humaines, plusieurs études se sont concentrées sur des animaux tels que des furets, des hamsters, des chats, et des singes pour déterminer leur susceptibilité et leur aptitude comme modèles animaux.

Trouver et représentation SARS-CoV-2 en tissus a été principalement fait suivre des méthodes conventionnelles d'immunohistochimie. Cependant, puisque ceux-ci sont basés seulement sur les parties minces de tissus, elles ne fournissent pas une illustration spatiale complète de l'infection.

Des avances dans des méthodes optiques de disculpation (TOC) de tissu ont permis à de grands tissus intacts d'être rendus optiquement clairs. Ceci élimine le besoin d'examen médical sectionnant et fournit une image 3D utilisant le sectionnement optique.

Deux études ont précédemment rapporté utilisant la représentation 3D du tissu de poumon de SARS-CoV-2-infected. Une étude a employé la tomographie de phase-contraste pour étudier le tissu de poumon non souillé. L'autre souillures H&E-analogiques fluorescentes rapportées d'étude pour obtenir la représentation 3D pseudo-histologique.

Flux de travail pour LSFM-CLSM corrélatif des tissus de furet de SARS-CoV-2-infected. (a) Des conques nasales et le tissu de poumons des furets de SARS-CoV-2-infected ont été rassemblés, garnis, et immunostained contre la protéine de SARS-CoV-2 N. Entièrement déshydraté et optiquement des échantillons transparents ont été acquis in toto avec un microscope léger de feuille et par la suite subsectioned à 1 parties millimètre-épaisses pour la microscopie à balayage laser confocal corrélative. (b) L
Flux de travail pour LSFM-CLSM corrélatif des tissus de furet de SARS-CoV-2-infected. (a) Des conques nasales et le tissu de poumons des furets de SARS-CoV-2-infected ont été rassemblés, garnis, et immunostained contre la protéine de SARS-CoV-2 N. Entièrement déshydraté et optiquement des échantillons transparents ont été acquis in toto avec un microscope léger de feuille et par la suite subsectioned à 1 parties millimètre-épaisses pour la microscopie à balayage laser confocal corrélative. (b) L'immunohistochimique représentative pour SARS450 CoV-2 N en cellules VeroE6 infectées utilisant un anti sérum polyclonal disponible dans le commerce de Radars à ouverture synthétique-CoV N (#1, vert) et un mélange monoclonal d'anti-RADAR À OUVERTURE SYNTHÉTIQUE-CoV N (#2, magenta) confirme la spécificité d'anticorps. Bleu : Hoechst33342. L'écaille barre = le µm 15. (c) Échantillons représentatifs de voies respiratoires de furet avant (parti) et après immunohistochimique (droite) et disculpation optique ECi basée sur. Les photos des parties de poumon (inférieures) montrent deux échantillons indépendants. Longueur d'arête de grand dos de réseau : 1 millimètre.

représentation 3D des prélèvements de tissu épais

Les chercheurs, dans une étude neuve, ont montré une image 3D complète de l'infection SARS-CoV-2 dans un furet. L'équipe a rassemblé nasal, trachée, et des prélèvements de tissu de poumon des furets infectés, euthanized quatre jours après infection, après avoir assuré le virus ont été inactivés.

Ils ont alors ajouté des anticorps et ont souillé la protéine virale de nucleocapsid pour s'assurer que la fluorescence a été vue seulement des cellules du virus SARS-CoV-2. Après avoir rendu les prélèvements de tissu optiquement clairs utilisant un protocole basé sur cinnamate éthylique, ils imagés ils utilisant la microscopie à fluorescence de nappe de lumière. Ils ont également découpé les prélèvements de tissu en parties minces et imagé elles utilisant la microscopie à balayage laser confocal.

Utilisant la microscopie à fluorescence de nappe de lumière, les auteurs pouvaient à l'image les prélèvements de tissu épais de 4 millimètres. Ils ont trouvé plusieurs endroits d'infection dans les voies respiratoires supérieures.

Seulement l
Seulement l'antigène SARS-CoV-2 saleté-associé était détectable en tissu de poumon de furet à la goujon-infection de 4 jours. (a) Projection volumétrique d'une grande partie de tissu de poumon. Tandis que la souillure de mouvement propre est détectable pour le mélange d'anticorps monoclonal (#2, magenta), aucune superposition de signe avec de l'anticorps polyclonal (#1, vert) n'est visible. Bleu-vert/gamme de gris = autofluorescence. Longueur d'arête des carrés de treillis = µm 800. Agrandissement total = 1.6x. (b) Les angles de visualisation alternes indiquent un endroit à l'intérieur d'une voie aérienne où les deux signes colocalize (boîtier blanc dans (a)). Le contraire aux orientations associées par SARS-CoV-2- sur les schémas 2 et 3, le signe superposant est mensonge trouvé sur le haut la couche épithéliale, proposant que ce soit les saletés le plus susceptibles de cellules inhalées de l'URT.

Sur la représentation avec un plus grand agrandissement de 8x et pratiquement du déplacement par une pile d'image, l'équipe a trouvé les remarques d'infection par un virus perceptibles par des limites claires.

Les images ont fourni un large panorama de l'infection dans les voies respiratoires supérieures et si les détails des points chauds d'infection individuelle aiment leur endroit et distances entre eux.

Les auteurs ont également effectué l'analyse d'image sur les images obtenues, qui leur ont permises d'obtenir des paramètres quantitatifs des images. Ceci représente un avantage prononcé de la représentation de l'immunofluorescence 3D au-dessus de l'analyse traditionnelle d'immunohistochimique, écrivent les auteurs.

En plus de la représentation 3D, les auteurs ont également découpé les tissus en parties minces et l'imagé les hotspots d'infection utilisant la microscopie confocale pour obtenir les petits groupes sous-cellulaires. Ils pouvaient résoudre les différentes cellules SARS-CoV-2 infectées et les ont vues en cellules ciliées et non-ciliées. La protéine de nucleocapsid accumulée plus du côté apical des cellules ciliées.

Emplacement d'infection dans les voies respiratoires

Les auteurs également imagés les voies respiratoires inférieures des furets. Ils ont trouvé quelques signes non spécifiés de fluorescence dans les tissus de trachée de poumons. Lors une inspection plus minutieuse, ils ont trouvé un µm 172 par le grand endroit d'infection de 102 µm caché dans la voie aérienne de tissu de poumon.

Le contraire à l'endroit d'infection dans le tissu des voies nasales du furet, l'infection a été localisé au-dessus de la couche de cellule épithéliale. Ceux-ci peuvent être à cause des saletés de virus, qui étaient vraisemblablement inhalées des endroits localisés d'infection dans les voies respiratoires supérieures.

Les études précédentes sur des furets n'ont trouvé aucun antigène dans les voies respiratoires inférieures, seulement un peu d'ARN viral. Ceci propose que le SARS-CoV-2 infecte préférentiellement les voies respiratoires supérieures. Mais, il peut également y avoir une certaine infection négligée dans les voies respiratoires inférieures.

Le contraire à l'infection chez l'homme, où l'infection est vue dans les voies respiratoires supérieures et inférieures, infection dans les furets est principalement vu dans les voies respiratoires supérieures. Ces principes utilisés dans cette étude pourraient être employés pour d'autres modèles animaux qui représentent plus attentivement les configurations humaines d'infection.

Dans une partie de 2003 millimètres du tissu de voies nasales, les auteurs ont vu seulement quatre endroits infectés, trois dont étaient à une distance maximum de 1,3 millimètres entre eux. Le degré limité est infection est comparé intéressant aux quantités de virus infectieux qui peuvent être isolées dans des furets.

Cette observation peut également être importante en rassemblant des échantillons des modèles animaux. Les écouvillons nasaux peuvent fournir de meilleurs résultats que les lavages nasaux dans les furets.

Cependant, plus d'études peuvent être requises justifier le groupement et les configurations focales de l'infection SARS-CoV-2. La combinaison de la microscopie à fluorescence confocale et de la microscopie à fluorescence de nappe de lumière peut permettre in vivo des études des procédés sous-cellulaires de l'infection SARS-CoV-2.

Avis *Important

le bioRxiv publie les états scientifiques préliminaires qui pair-ne sont pas observés et ne devraient pas, en conséquence, être considérés comme concluants, guident la pratique clinique/comportement relatif à la santé, ou traité en tant qu'information déterminée.

Journal reference:
Lakshmi Supriya

Written by

Lakshmi Supriya

Lakshmi Supriya got her BSc in Industrial Chemistry from IIT Kharagpur (India) and a Ph.D. in Polymer Science and Engineering from Virginia Tech (USA).

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