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rappresentazione 3D dell'infezione SARS-CoV-2 in furetti facendo uso di microscopia leggera della lamiera sottile

I ricercatori da Friedrich-Loeffler-Institut, istituto di ricerca federale per salute degli animali dimostrano la capacità di individuare l'infezione di coronavirus 2 di sindrome respiratorio acuto severo (SARS-CoV-2) nei campioni di tessuto 3D in furetti. Ciò permetterà la rilevazione dei reticoli di infezione in tessuti e nelle loro interrelazioni.  La ricerca è pubblicata sul bioRxiv* del " server " della pubblicazione preliminare nell'ottobre 2020.

Il virus SARS-CoV-2 che causa la pandemia COVID-19 è un virus a RNA unico incagliato. Il virus è pensato per essere trasmesso dagli animali, sebbene non ci sia prova ancora della trasmissione diretta.

Oltre a studiare i meccanismi molecolari e biologici dell'infezione virale sulle cellule umane, parecchi studi hanno messo a fuoco sugli animali quali i furetti, i criceti, i caponi e le scimmie per determinare la loro predisposizione e la loro idoneità come modelli animali.

La rilevazione e la rappresentazione SARS-CoV-2 in tessuti pricipalmente sono state fatte facendo uso dei metodi convenzionali del immunohistochemistry. Tuttavia, poiché questi sono basati soltanto sulle sezioni sottili dei tessuti, non forniscono una maschera spaziale completa dell'infezione.

Gli avanzamenti nei metodi ottici di schiarimento (TOC) del tessuto hanno permesso che i grandi tessuti intatti fossero dichiarati otticamente. Ciò elimina l'esigenza del fisico medica che seziona e fornisce un'immagine 3D facendo uso della divisione ottica.

Due studi precedentemente hanno riferito facendo uso della rappresentazione 3D del tessuto polmonare di SARS-CoV-2-infected. Uno studio ha usato la tomografia di fase-contrasto per studiare il tessuto polmonare non macchiato. L'altro studio ha riferito le macchie fluorescenti di H&E-analogo per ottenere la rappresentazione pseudo-istologica 3D.

Flusso di lavoro per il correlativo LSFM-CLSM dei tessuti del furetto di SARS-CoV-2-infected. (A) Il tessuto polmonare e dei conchae nasali dai furetti di SARS-CoV-2-infected è stato raccolto, sistemato stato e immunostained contro la proteina di SARS-CoV-2 N. Completamente disidratato ed otticamente i campioni trasparenti si sono acquistati in toto con un microscopio leggero della lamiera sottile e successivamente subsectioned alle sezioni millimetro-spesse 1 per microscopia confocale correlativa di laser-scansione. (B) il rappresentante che immunostaining per SARS450 CoV-2 N in celle infettate VeroE6 facendo uso di anti siero policlonale disponibile nel commercio di SAR-CoV N (#1, verde) e di una miscela monoclonale di anti-SAR-CoV N (#2, magenta) conferma la specificità dell
Flusso di lavoro per il correlativo LSFM-CLSM dei tessuti del furetto di SARS-CoV-2-infected. (A) Il tessuto polmonare e dei conchae nasali dai furetti di SARS-CoV-2-infected è stato raccolto, sistemato stato e immunostained contro la proteina di SARS-CoV-2 N. Completamente disidratato ed otticamente i campioni trasparenti si sono acquistati in toto con un microscopio leggero della lamiera sottile e successivamente subsectioned alle sezioni millimetro-spesse 1 per microscopia confocale correlativa di laser-scansione. (B) il rappresentante che immunostaining per SARS450 CoV-2 N in celle infettate VeroE6 facendo uso di anti siero policlonale disponibile nel commercio di SAR-CoV N (#1, verde) e di una miscela monoclonale di anti-SAR-CoV N (#2, magenta) conferma la specificità dell'anticorpo. Blu: Hoechst33342. Il disgaggio esclude = il µm 15. (C) campioni rappresentativi delle vie respiratorie del furetto prima (andato) e dopo (giusto) schiarimento ottico immunostaining e ECi basato. Le fotografie dalle sezioni del polmone (inferiori) mostrano due campioni indipendenti. Lunghezza della barriera del quadrato della griglia: 1 millimetro.

rappresentazione 3D dei campioni di tessuto spessi

I ricercatori, in un nuovo studio, hanno indicato un'immagine completa 3D dell'infezione SARS-CoV-2 in un furetto. Il gruppo ha raccolto nasale, trachea ed i campioni del tessuto polmonare dai furetti infettati, eutanasizzati i quattro giorni dopo l'infezione, dopo l'assicurazione del virus sono stati inattivati.

Poi hanno aggiunto gli anticorpi e che hanno macchiato la proteina virale del nucleocapsid per assicurare che la fluorescenza fosse veduta soltanto dalle celle del virus SARS-CoV-2. Dopo avere dichiarato i campioni di tessuto otticamente facendo uso ad un di un protocollo basato a cinnamato etilico, essi imaged loro facendo uso di microscopia di fluorescenza della luminoso lamiera sottile. Egualmente hanno affettato i campioni di tessuto in sezioni sottili ed imaged loro facendo uso di microscopia confocale di laser-scansione.

Facendo uso di microscopia di fluorescenza della luminoso lamiera sottile, gli autori potevano all'immagine campioni di tessuto spessi da 4 millimetri. Hanno trovato parecchi punti di infezione nelle vie respiratorie superiori.

Soltanto l
Soltanto l'antigene detrito-associato SARS-CoV-2 era rilevabile nel tessuto polmonare del furetto ad un'post-infezione dei 4 giorni. (A) Proiezione volumetrica di grande sezione del tessuto polmonare. Mentre una certa macchiatura di sfondo è rilevabile per la miscela dell'anticorpo monoclonale (#2, magenta), non c'è nessuna sovrapposizione del segnale con l'anticorpo policlonale (#1, verde) visibile. Ciano/gradazione di grigio = autofluorescence. Lunghezza della barriera dei quadrati a griglia = µm 800. Ingrandimento totale = 1.6x. (B) gli angoli di visione alterni rivelano un punto dentro le vie respiratorie in cui entrambi i segnali colocalize (casella bianca dentro (A)). Il contrario al SARS-CoV-2- ha associato i fuochi nella figure 2 e 3, il segnale di sovrapposizione sono menzogne individuata sulla cima il livello epiteliale, suggerente che sia detriti più probabili delle cellule inalati dal URT.

Sopra la rappresentazione con un ingrandimento aumentato di 8x e virtualmente di attraversare through una pila di immagine, il gruppo ha trovato i punti di infezione virale distinguibili segnati con i chiari limiti.

Le immagini hanno fornito una vasta generalità dell'infezione nelle vie respiratorie superiori e se i dettagli di diverse aree sensibili di infezione gradiscono la loro area e distanze loro.

Gli autori egualmente hanno eseguito l'analisi sulla base di immagini sulle immagini ottenute, che li hanno permessi di ottenere i parametri quantitativi dalle immagini. Ciò rappresenta un vantaggio pronunciato della rappresentazione dell'immunofluorescenza 3D sopra l'analisi immunohistochemical tradizionale, scrive gli autori.

Oltre alla rappresentazione 3D, gli autori egualmente hanno affettato i tessuti in sezioni sottili ed il imaged i hotspot di infezione facendo uso di microscopia confocale per ottenere i dettagli sottocellulari. Potevano risolvere le diverse celle infettate SARS-CoV-2 e le hanno vedute in sia celle ciliate che non ciliate. La proteina del nucleocapsid ha accumulato più dal lato apicale delle celle ciliate.

Posizione di infezione nelle vie respiratorie

Gli autori anche imaged le vie respiratorie più basse dei furetti. Hanno trovato alcuni segnali non specificati della fluorescenza nei tessuti della trachea dei polmoni. Sopra ispezione più ravvicinata, hanno trovato un µm 172 dal grande punto di infezione di 102 µm nascosto nelle vie respiratorie del tessuto polmonare.

Il contrario al punto di infezione nel tessuto del passaggio nasale del furetto, l'infezione è stato localizzato sopra il livello delle cellule epiteliali. Questi possono essere a causa dei detriti del virus, che probabilmente sono stati inalati dai punti localizzati di infezione nelle vie respiratorie superiori.

Gli studi precedenti sui furetti non hanno trovato alcuni antigeni nelle vie respiratorie più basse, soltanto una piccola quantità di RNA virale. Ciò suggerisce che il SARS-CoV-2 infetti preferenziale le vie respiratorie superiori. Ma, ci può anche essere una certa infezione trascurata nelle vie respiratorie più basse.

Il contrario all'infezione in esseri umani, in cui l'infezione è veduta sia nelle vie respiratorie superiori che più basse, infezione in furetti pricipalmente è veduto nelle vie respiratorie superiori. Questi principi utilizzati in questo studio potrebbero essere usati per altri modelli animali che rappresentano più molto attentamente i reticoli umani di infezione.

In una sezione da 2003 millimetri del tessuto del passaggio nasale, gli autori hanno veduto soltanto quattro punti infettati, tre di cui erano ad una distanza massima di 1,3 millimetri l'uno dall'altro. Il grado limitato è infezione è interessante confrontato agli importi del virus contagioso che possono essere isolati dai furetti.

Questa osservazione può anche essere importante quando raccoglie i campioni dai modelli animali. I tamponi nasali possono fornire i migliori risultati che i lavaggi nasali in furetti.

Tuttavia, più studi possono essere richiesti di confermare il raggruppamento ed i reticoli focali dell'infezione SARS-CoV-2. La combinazione di microscopia di fluorescenza confocale di microscopia e della luminoso lamiera sottile di fluorescenza può permettere in vivo gli studi sui trattamenti sottocellulari di infezione SARS-CoV-2.

Avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
Lakshmi Supriya

Written by

Lakshmi Supriya

Lakshmi Supriya got her BSc in Industrial Chemistry from IIT Kharagpur (India) and a Ph.D. in Polymer Science and Engineering from Virginia Tech (USA).

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