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imagem lactente 3D da infecção SARS-CoV-2 nas doninhas usando a microscopia clara da folha

Os pesquisadores do Friedrich-Loeffler-Institut, instituto de investigação federal para a sanidade animal demonstram a capacidade para detectar a infecção do coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2) em amostras de tecido 3D nas doninhas. Isto permitirá a detecção de testes padrões da infecção nos tecidos e nas suas inter-relações.  A pesquisa é publicada sobre o bioRxiv* do server da pré-impressão em outubro de 2020.

O vírus SARS-CoV-2 que causa a pandemia COVID-19 é um vírus único-encalhado do RNA. O vírus é pensado para ter sido transmitido dos animais, embora não há nenhuma evidência contudo da transmissão directa.

Independentemente de estudar os mecanismos moleculars e biológicos da infecção viral em pilhas humanas, diversos estudos focalizaram em animais tais como doninhas, hamster, gatos, e macacos para determinar sua susceptibilidade e sua conformidade como os modelos animais.

A detecção e a imagem lactente SARS-CoV-2 nos tecidos foram feitas principalmente usando métodos convencionais do immunohistochemistry. Contudo, desde que estes são baseados somente em secções finas dos tecidos, não fornecem uma imagem espacial completa da infecção.

Os avanços em métodos ópticos do esclarecimento (TOC) do tecido permitiram que os grandes tecidos intactos sejam feitos óptica claros. Isto elimina a necessidade para o exame que secciona e fornece uma imagem 3D usando a secção óptica.

Dois estudos têm relatado previamente usando a imagem lactente 3D do tecido de pulmão de SARS-CoV-2-infected. Um estudo usou o tomografia do fase-contraste para estudar o tecido de pulmão unstained. O outro estudo relatou manchas H&E-análogas fluorescentes para obter a imagem lactente 3D pseudo--histológica.

Trabalhos para LSFM-CLSM correlativo de tecidos da doninha de SARS-CoV-2-infected. (a) O tecido de conchae nasais e de pulmões das doninhas de SARS-CoV-2-infected foi recolhido, aparado, e immunostained contra a proteína de SARS-CoV-2 N. Desidratado inteiramente e as amostras transparentes foram adquiridas óptica in toto com um microscópio leve da folha e subsectioned subseqüentemente às secções 1 milímetro-grossas para a microscopia confocal correlativa da laser-exploração. (b) O representante que immunostaining para SARS450 CoV-2 N nas pilhas VeroE6 contaminadas usando um anti soro polyclonal disponível no comércio de SARS-CoV N (#1, verde) e uma mistura monoclonal do anti-SARS-CoV N (#2, magentas) confirma a especificidade do anticorpo. Azul: Hoechst33342. A escala barra = o µm 15. (c) Amostras representativas das vias respiratórias da doninha antes (saido) e após do esclarecimento óptico immunostaining e ECi-baseado (direito). As fotografias das secções do pulmão (inferiores) mostram duas amostras independentes. Comprimento da borda do quadrado de grade: 1 milímetro.
Trabalhos para LSFM-CLSM correlativo de tecidos da doninha de SARS-CoV-2-infected. (a) O tecido de conchae nasais e de pulmões das doninhas de SARS-CoV-2-infected foi recolhido, aparado, e immunostained contra a proteína de SARS-CoV-2 N. Desidratado inteiramente e as amostras transparentes foram adquiridas óptica in toto com um microscópio leve da folha e subsectioned subseqüentemente às secções 1 milímetro-grossas para a microscopia confocal correlativa da laser-exploração. (b) O representante que immunostaining para SARS450 CoV-2 N nas pilhas VeroE6 contaminadas usando um anti soro polyclonal disponível no comércio de SARS-CoV N (#1, verde) e uma mistura monoclonal do anti-SARS-CoV N (#2, magentas) confirma a especificidade do anticorpo. Azul: Hoechst33342. A escala barra = o µm 15. (c) Amostras representativas das vias respiratórias da doninha antes (saido) e após do esclarecimento óptico immunostaining e ECi-baseado (direito). As fotografias das secções do pulmão (inferiores) mostram duas amostras independentes. Comprimento da borda do quadrado de grade: 1 milímetro.

imagem lactente 3D de amostras de tecido grossas

Os pesquisadores, em um estudo novo, mostraram uma imagem 3D completa da infecção SARS-CoV-2 em uma doninha. A equipe recolheu nasal, traqueia, e as amostras de tecido do pulmão das doninhas contaminadas, euthanized quatro dias após a infecção, após ter assegurado o vírus foram neutralizadas.

Então adicionaram anticorpos e mancharam a proteína viral do nucleocapsid para assegurar-se de que a fluorescência estivesse considerada somente das pilhas do vírus SARS-CoV-2. Após ter feito as amostras de tecido óptica claras usar um etilo cinnamate-baseou o protocolo, elas imaged elas que usam a microscopia de fluorescência da luz-folha. Igualmente cortaram as amostras de tecido em secções finas e imaged elas que usam a microscopia confocal da laser-exploração.

Usando a microscopia de fluorescência da luz-folha, os autores podiam à imagem amostras de tecido grossas de 4 milímetros. Encontraram diversos pontos da infecção nas vias respiratórias superiores.

Somente o antígeno SARS-CoV-2 resto-associado era detectável no tecido de pulmão da doninha em uma cargo-infecção de 4 dias. (a) Projecção volumétrico de uma grande secção do tecido de pulmão. Quando alguma mancha do fundo for detectável para a mistura do anticorpo monoclonal (#2, magenta), nenhuma sobreposição do sinal com o anticorpo polyclonal (#1, verde) é visível. Ciano/grayscale = autofluorescence. Afie o comprimento de quadrados de grade = o µm 800. Totalize a ampliação = o 1.6x. (b) Os ângulos de visão alternativos revelam um ponto dentro de uma via aérea onde ambos os sinais colocalize (a caixa branca em (a)). O contrário ao SARS-CoV-2- associou focos em figuras 2 e 3, o sinal de sobreposição são encontro detectado na parte superior a camada epitelial, sugerindo que seja restos de pilha mais provável inalados do URT.
Somente o antígeno SARS-CoV-2 resto-associado era detectável no tecido de pulmão da doninha em uma cargo-infecção de 4 dias. (a) Projecção volumétrico de uma grande secção do tecido de pulmão. Quando alguma mancha do fundo for detectável para a mistura do anticorpo monoclonal (#2, magenta), nenhuma sobreposição do sinal com o anticorpo polyclonal (#1, verde) é visível. Ciano/grayscale = autofluorescence. Afie o comprimento de quadrados de grade = o µm 800. Totalize a ampliação = o 1.6x. (b) Os ângulos de visão alternativos revelam um ponto dentro de uma via aérea onde ambos os sinais colocalize (a caixa branca em (a)). O contrário ao SARS-CoV-2- associou focos em figuras 2 e 3, o sinal de sobreposição são encontro detectado na parte superior a camada epitelial, sugerindo que seja restos de pilha mais provável inalados do URT.

Em cima da imagem lactente com uma ampliação aumentada de 8x e virtualmente da viagem através de uma pilha da imagem, a equipe encontrou pontos de infecção distinguíveis do vírus identificados por meio de limites claros.

As imagens forneceram uma vista geral larga da infecção nas vias respiratórias superiores e desde que os detalhes de hot spot individuais da infecção gostam de suas área e distâncias entre elas.

Os autores igualmente executaram a análise de imagem nas imagens obtidas, que permitiram que obtivessem parâmetros quantitativos das imagens. Isto representa uma vantagem pronunciada da imagem lactente da imunofluorescência 3D sobre a análise immunohistochemical tradicional, escreve os autores.

Além do que a imagem lactente 3D, os autores igualmente cortaram os tecidos em secções finas e o imaged os pontos quentes da infecção usando a microscopia confocal para obter detalhes subcelulares. Podiam resolver pilhas contaminadas SARS-CoV-2 individuais e viam-nas em pilhas ciliated e não-ciliated. A proteína do nucleocapsid acumulou mais no lado apical das pilhas ciliated.

Lugar da infecção nas vias respiratórias

Os autores igualmente imaged as vias respiratórias mais baixas das doninhas. Encontraram alguns sinais não especificads da fluorescência nos tecidos da traqueia dos pulmões. Em cima de uma inspecção mais próxima, encontraram um µm 172 ponto da infecção de 102 µm pelo grande escondido na via aérea do tecido de pulmão.

O contrário ao ponto da infecção no tecido da passagem nasal da doninha, a infecção foi localizado acima da camada da pilha epitelial. Estes podem ser devido aos restos do vírus, que foram inalados provavelmente dos pontos localizados da infecção nas vias respiratórias superiores.

Os estudos precedentes em doninhas não encontraram nenhuns antígenos nas vias respiratórias mais baixas, somente uma pequena quantidade do RNA viral. Isto sugere que o SARS-CoV-2 contamine preferencial as vias respiratórias superiores. Mas, pode igualmente haver alguma infecção negligenciada nas vias respiratórias mais baixas.

O contrário à infecção nos seres humanos, onde a infecção é considerada nas vias respiratórias superiores e mais baixas, infecção nas doninhas é considerado principalmente nas vias respiratórias superiores. Estes princípios usados neste estudo poderiam ser usados para outros modelos animais que representam mais pròxima testes padrões humanos da infecção.

Em uma secção de 2003 milímetros do tecido da passagem nasal, os autores viram somente quatro pontos contaminados, três de que estavam em uma distância máxima de 1,3 milímetros de se. O grau limitado é infecção é interessante comparado às quantidades de vírus infeccioso que podem ser isoladas das doninhas.

Esta observação pode igualmente ser importante ao recolher amostras dos modelos animais. Os cotonetes nasais podem fornecer melhores resultados do que lavagens nasais nas doninhas.

Contudo, mais estudos podem ser exigidos substanciar a aglomeração e os testes padrões focais da infecção SARS-CoV-2. A combinação de microscopia de fluorescência confocal da microscopia e da luz-folha de fluorescência pode permitir in vivo estudos de processos subcelulares da infecção SARS-CoV-2.

Observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
Lakshmi Supriya

Written by

Lakshmi Supriya

Lakshmi Supriya got her BSc in Industrial Chemistry from IIT Kharagpur (India) and a Ph.D. in Polymer Science and Engineering from Virginia Tech (USA).

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