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proyección de imagen 3D de la infección SARS-CoV-2 en hurónes usando microscopia liviana de la hoja

Los investigadores de Friedrich-Loeffler-Institut, instituto de investigación federal para la salud de los animales demuestran la capacidad de descubrir la infección del coronavirus 2 de la neumonía asiática (SARS-CoV-2) en muestras de tejido 3D en hurónes. Esto permitirá la detección de las configuraciones de la infección en tejidos y sus interrelaciones.  La investigación se publica sobre el bioRxiv* del servidor de la prueba preliminar en octubre de 2020.

El virus SARS-CoV-2 que causa el pandémico COVID-19 es un virus de una sola fila del ARN. El virus se piensa para haber sido transmitido de animales, aunque no hay pruebas con todo de la transmisión directa.

Aparte de estudiar los mecanismos moleculares y biológicos de la infección viral en las células humanas, varios estudios se han centrado en animales tales como hurónes, hámsteres, gatos, y grapas para determinar su susceptibilidad y su conveniencia como modelos animales.

El descubrir y la proyección de imagen SARS-CoV-2 en tejidos se ha hecho principal usando métodos convencionales del immunohistochemistry. Sin embargo, puesto que éstos se basan solamente en secciones finas de tejidos, no ofrecen un retrato espacial completo de la infección.

Los avances en métodos ópticos del claro (TOC) del tejido han permitido que los tejidos intactos grandes sean hechos ópticamente sin obstrucción. Esto elimina la necesidad de la comprobación que secciona y ofrece una imagen 3D usando el seccionamiento óptico.

Dos estudios han denunciado previamente usando la proyección de imagen 3D del tejido pulmonar de SARS-CoV-2-infected. Un estudio utilizó la tomografía del fase-contraste para estudiar el tejido pulmonar sin manchas. El otro estudio denunció manchas de óxido H&E-analógicas fluorescentes para obtener la proyección de imagen pseudo-histológica 3D.

Flujo de trabajo para LSFM-CLSM correlativo de los tejidos del hurón de SARS-CoV-2-infected. (a) El tejido pulmonar de los conchae nasales y de hurónes de SARS-CoV-2-infected cerco, fue ajustado, e immunostained contra la proteína de SARS-CoV-2 N. Deshidratado completo y ópticamente las muestras transparentes fueron detectadas in toto con un microscopio liviano de la hoja y subsectioned posteriormente a las secciones milímetro-gruesas 1 para la microscopia confocal correlativa de la laser-exploración. (b) El representante immunostaining para SARS450 CoV-2 N en las células infectadas VeroE6 usando un suero anti policlonal disponible en el comercio de los SARS-CoV N (#1, verde) y una mezcla monoclonal del anti-SARS-CoV N (#2, magentas) confirma especificidad del anticuerpo. Azul: Hoechst33342. La escala barra = el µm 15. (c) Muestras representativas de las vías respiratorias del hurón antes (ido) y después del claro óptico immunostaining y ECi-basado (correcto). Las fotografías de las secciones del pulmón (inferiores) muestran dos muestras independientes. Largo del filo del cuadrado de rejilla: 1 milímetro.
Flujo de trabajo para LSFM-CLSM correlativo de los tejidos del hurón de SARS-CoV-2-infected. (a) El tejido pulmonar de los conchae nasales y de hurónes de SARS-CoV-2-infected cerco, fue ajustado, e immunostained contra la proteína de SARS-CoV-2 N. Deshidratado completo y ópticamente las muestras transparentes fueron detectadas in toto con un microscopio liviano de la hoja y subsectioned posteriormente a las secciones milímetro-gruesas 1 para la microscopia confocal correlativa de la laser-exploración. (b) El representante immunostaining para SARS450 CoV-2 N en las células infectadas VeroE6 usando un suero anti policlonal disponible en el comercio de los SARS-CoV N (#1, verde) y una mezcla monoclonal del anti-SARS-CoV N (#2, magentas) confirma especificidad del anticuerpo. Azul: Hoechst33342. La escala barra = el µm 15. (c) Muestras representativas de las vías respiratorias del hurón antes (ido) y después del claro óptico immunostaining y ECi-basado (correcto). Las fotografías de las secciones del pulmón (inferiores) muestran dos muestras independientes. Largo del filo del cuadrado de rejilla: 1 milímetro.

proyección de imagen 3D de las muestras de tejido gruesas

Los investigadores, en un nuevo estudio, han mostrado una imagen completa 3D de la infección SARS-CoV-2 en un hurón. Las personas cerco nasal, tráquea, y las muestras del tejido pulmonar de los hurónes infectados, euthanized cuatro días después de la infección, después de asegurar el virus fueron desactivadas.

Después agregaron los anticuerpos y mancharon la proteína viral del nucleocapsid para asegurarse que la fluorescencia fue considerada solamente de las células del virus SARS-CoV-2. Después de hacer las muestras de tejido ópticamente sin obstrucción usando un protocolo cinamato-basado de etilo, ellas reflejadas ellas usando microscopia de fluorescencia de la luz-hoja. También cortaron las muestras de tejido en secciones finas y reflejado ellas usando microscopia confocal de la laser-exploración.

Usando microscopia de fluorescencia de la luz-hoja, los autores podían a la imagen las muestras de tejido gruesas de 4 milímetros. Encontraron varios sitios de la infección en las vías respiratorias superiores.

Solamente el antígeno escombro-asociado SARS-CoV-2 era perceptible en tejido pulmonar del hurón en la poste-infección de 4 días. (a) Proyección volumétrica de una sección grande del tejido pulmonar. Mientras que una cierta coloración del fondo es perceptible para la mezcla del anticuerpo monoclonal (#2, magenta), no hay recubrimiento de la señal con el anticuerpo policlonal (#1, verde) visible. Color cianita/grayscale = autofluorescence. Largo del filo de retículas cuadradas = µm 800. Aumento total = 1.6x. (b) Los ángulos de visión alternos revelan un sitio dentro de una aerovía donde ambas señales colocalize (la caja blanca en (a)). El contrario al SARS-CoV-2- asoció focos en los cuadros 2 y 3, la señal que recubre es mentira descubierta en capota la capa epitelial, sugiriendo que es escombros de célula más probable inhalados del URT.
Solamente el antígeno escombro-asociado SARS-CoV-2 era perceptible en tejido pulmonar del hurón en la poste-infección de 4 días. (a) Proyección volumétrica de una sección grande del tejido pulmonar. Mientras que una cierta coloración del fondo es perceptible para la mezcla del anticuerpo monoclonal (#2, magenta), no hay recubrimiento de la señal con el anticuerpo policlonal (#1, verde) visible. Color cianita/grayscale = autofluorescence. Largo del filo de retículas cuadradas = µm 800. Aumento total = 1.6x. (b) Los ángulos de visión alternos revelan un sitio dentro de una aerovía donde ambas señales colocalize (la caja blanca en (a)). El contrario al SARS-CoV-2- asoció focos en los cuadros 2 y 3, la señal que recubre es mentira descubierta en capota la capa epitelial, sugiriendo que es escombros de célula más probable inhalados del URT.

Sobre proyección de imagen con un aumento creciente de 8x y virtualmente de viajar a través de una pila de la imagen, las personas encontraron puntos de infección distinguibles del virus marcados con límites sin obstrucción.

Las imágenes ofrecieron una reseña amplia de la infección en las vías respiratorias superiores y con tal que los detalles de los sitios calientes de la infección individual tengan gusto de su área y distancias entre ellas.

Los autores también realizaron análisis de imagen en las imágenes obtenidas, que permitieron que consiguieran parámetros cuantitativos de las imágenes. Esto representa una ventaja pronunciada de la proyección de imagen de la inmunofluorescencia 3D sobre análisis immunohistochemical tradicional, escribe a los autores.

Además de la proyección de imagen 3D, los autores también cortaron los tejidos en secciones finas y el reflejado los apuroses de la infección usando microscopia confocal para obtener a los detalles subcelulares. Podían resolver las células infectadas SARS-CoV-2 individuales y las vieron en células ciliated y no-ciliated. La proteína del nucleocapsid acumuló más en el lado apical de las células ciliated.

Situación de la infección en vías respiratorias

Los autores también reflejados las vías respiratorias más inferiores de los hurónes. Encontraron algunas señales sin especificar de la fluorescencia en los tejidos de la tráquea de los pulmones. Sobre una inspección más cercana, encontraron un µm 172 por el sitio grande de la infección de 102 µm ocultado en la aerovía del tejido pulmonar.

El contrario al sitio de la infección en el tejido del pasaje nasal del hurón, la infección fue localizado encima de la capa de la célula epitelial. Éstos pueden estar debido a los escombros del virus, que fueron inhalados probablemente de sitios localizados de la infección en las vías respiratorias superiores.

Los estudios anteriores en hurónes no encontraron ninguna antígenos en las vías respiratorias más inferiores, solamente una pequeña cantidad del ARN viral. Esto sugiere que el SARS-CoV-2 infecte preferencial las vías respiratorias superiores. Pero, puede también haber una cierta infección pasada por alto en las vías respiratorias más inferiores.

El contrario a la infección en los seres humanos, donde la infección se considera en las vías respiratorias superiores y más inferiores, infección en hurónes se considera principal en las vías respiratorias superiores. Estos principios usados en este estudio se podrían utilizar para otros modelos animales que representan más de cerca configuraciones humanas de la infección.

En una sección de 2003 milímetros del tejido del pasaje nasal, los autores vieron solamente cuatro sitios infectados, tres cuyo estaban en una distancia máxima de 1,3 milímetros de uno a. El grado limitado es infección es interesante comparado a las cantidades de virus infeccioso que pueden ser aisladas de hurónes.

Esta observación puede también ser importante al cerco muestras de los modelos animales. Los lampazos nasales pueden ofrecer mejores resultados que estelas turbulentas nasales en hurónes.

Sin embargo, más estudios se pueden requerir verificar el agrupamiento y las configuraciones focales de la infección SARS-CoV-2. La combinación de la microscopia de fluorescencia confocal de la microscopia y de la luz-hoja de fluorescencia puede permitir in vivo estudios de los procesos subcelulares de la infección SARS-CoV-2.

Advertencia *Important

el bioRxiv publica los partes científicos preliminares que par-no se revisan y, por lo tanto, no se deben mirar como concluyentes, conduce práctica clínica/comportamiento relativo a la salud, o tratado como información establecida.

Journal reference:
Lakshmi Supriya

Written by

Lakshmi Supriya

Lakshmi Supriya got her BSc in Industrial Chemistry from IIT Kharagpur (India) and a Ph.D. in Polymer Science and Engineering from Virginia Tech (USA).

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