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Nuovo inibitore della traduzione del RNA SARS-CoV-2

Mentre la ricerca di efficace coronavirus di sindrome respiratorio acuto severo 2 inibitori (SARS-CoV-2) continua, uno studio recente dai ricercatori della scuola di medicina di Yale University ha pubblicato sui rapporti del bioRxiv* del " server " della pubblicazione preliminare nell'ottobre 2020 l'effetto inibitorio del merofloxacin della droga sul frameshifting durante la replica SARS-CoV-2. Ciò è un proof of concept importante che supporta il potenziale per l'ottimizzazione del PRF −1 come efficace terapia antivirale in questa pandemia come pure contro altra beta-coronaviruses.

Traduzione e Frameshifting di ORF1ab

SARS-CoV-2 lega alla cellula ospite via la sua proteina della punta e comincia a ripiegare per stabilire l'infezione. La traduzione delle proteine virali comincia lungamente dal frammento di ORF1ab, che è il di gran lunga più grande, che oltre 21 KB e comprendere 2/3 il tutto unico ha incagliato il genoma.

Codifica un poliproteico, che poi è fenduto in 16 proteine nonstructural (nsp) tramite l'atto di due proteasi. Molte proteine sulla seconda metà del gioco di poliproteico un la parte vitale nella trascrizione e nella replica virali. Ciò include nsp12, un RNA polimerasi RNA-dipendente (RdRp), helicase del RNA (Hel/nsp13) e un exoribonuclease di correzione delle bozze, tra l'altro.

La traduzione di ORF1b, il 3' lato di ORF1ab, richiede un'alterazione dello schema di lettura di accadere in tutti i coronaviruses. Quando i ribosomi raggiungono la conclusione di ORF1a, alcuni di loro necessità di muoversi nella direzione retrograda da un nucleotide. Ciò è l'alterazione dello schema di lettura ribosomiale programmata -1 (- 1 PRF).

A seguito di questa alterazione dello schema di lettura, continuano a tradurre il resto del ORF nel nuovo telaio della lettura -1 fino a tradurre il grande poliproteico di tutto. Se non, presto arriveranno ad un codone di arresto nei 0 telai, che cesserà prematuramente la traduzione. Ciò renderà non valida la replicazione virale.

Uno schermo di alto-capacità di lavorazione identifica i modulatori di PRF di SARS-CoV-2 −1.
Uno schermo di alto-capacità di lavorazione identifica i modulatori di PRF di SARS-CoV-2 −1.

Strutture di FSE

La regione di PRF −1 è trovata spesso per contenere una sequenza sdrucciolevole di 7 nucleotidi (UUUAAAC in SARS-CoV-2) e una struttura secondaria stabile a valle quella funzioni come elemento distimolazione (FSE). Questo ultimo determina le pause brevi nel movimento in avanti del ribosoma, concedendo il momento dei tRNAs di raggiungere l'allineamento corretto riguardo alla sequenza sdrucciolevole. Ciò è richiesta parzialmente per il Frameshifting ribosomiale programmato -1 (PRF).

Un FSE comune è lo pseudoknot del RNA. In SAR-CoV, SARS-CoV-2 ed altri betacoronaviruses, è pensato che forse uno pseudoknot del tre-gambo possa fungere da FSE. Questa struttura non è molto comune nei mRNAs ospite. È, quindi usato spesso verificare l'effetto esplicitamente di interruzione dell'espressione genica virale, come dalle mutazioni e dalle droghe che inibiscono il PRF -1.

Ciò è stata dimostrata nella replica del HIV, sia da un inibitore esogeno di PRF -1 che dalle bugne che indicano che fa parte della risposta antivirale di ospite.

Merofloxacin inibisce la replica SARS-CoV-2

Nello studio corrente, i ricercatori hanno identificato il merofloxacin antibiotico di fluoroquinolone per la selezione di alto-capacità di lavorazione per gli inibitori di PRF −1 di SARS-CoV-2. Mostrano quell'incubazione con questa replica soppressa composto SARS-CoV-2 in celle di Vero.

Sebbene il ivermectin sia egualmente un inibitore di PRF -1, ha avuto effetti di citotossicità, a differenza del merofloxacin, che ha soltanto effetti citostatici modesti anche agli alti livelli. È un inibitore specifico di PRF di betacoronavirus -1, a differenza di altri fluoroquinolones che mancano di questa attività. Ciò suggerisce che i gruppi strutturali a determinati siti specifici possano essere responsabili dell'inibizione di alterazione dello schema di lettura.

Poiché il FSE della sequenza SAR-CoV è quasi identico a quello di SARS-CoV-2, il merofloxacin inibisce quasi ugualmente 1 - alterazione dello schema di lettura in entrambi. La concentrazione inibitoria mezzo massima (IC50) è μM ~20, che è superiore all'inibizione di 25% prodotta da un altro inibitore chiamato SHFL.

Merafloxacin è un inibitore specifico del betacoronavirus FSEs, ma non di altri coronaviruses o di altri virus comuni. Altri coronaviruses stagionali hanno una struttura più elaborata dello pseudoknot, a differenza dello pseudoknot di 3 gambi dei betacoronaviruses.

L'inibizione di Merofloxacin resiste alle mutazioni di fuga

I ricercatori egualmente hanno trovato che da inibizione indotta merofloxacin di alterazione dello schema di lettura persiste malgrado le mutazioni nel genoma virale. I virus a RNA sono conosciuti per avere una tariffa rapida di mutazione, alcuna di cui può rendere il virus resistente all'agente antivirale. Lo studio ha compreso le mutazioni già conosciute per esistere nel virus.

Hanno trovato molto poche mutazioni nella sequenza di FSE, che deve essere preveduta alla luce della grande importanza di PRF -1 alla replicazione virale. Fra 20 mutazioni in questa regione, niente di meno che 16 hanno accaduto soltanto una volta. Dei quattro rimanenti, due sono in gambo 1 ed uno ciascuno in gambi 2 e 3.

Essendo sul gambo, nessuno di questi ha potuto provocare un'alterazione nella struttura del tre-gambo dello pseudoknot. Tuttavia, i ricercatori hanno trovato che l'inibizione di PRF -1 dal merofloxacin si è presentata con tutte queste varianti senza perdita di efficacia.

Continuando da queste mutazioni già attuali che non hanno cambiato la struttura dello pseudoknot, poi hanno esplorato l'effetto di altre mutazioni che hanno disturbato la struttura. Hanno trovato che questi hanno causato una riduzione del frameshifting da 10% - 77%, secondo la loro rottura. Una delle riduzioni più significative è stata causata da una mutazione in singola uridina spaiata, indicante che ha una funzione sconosciuta. Entrambe questa mutazione, U13485 ed i seguenti G13486 completamente sono conservati fra i coronaviruses umani.

Sebbene queste mutazioni generino una vasta gamma di perturbazioni strutturali, l'inibizione di alterazione dello schema di lettura prodotta dal merofloxacin che agisce su tutte queste varianti è rimanere quasi la stessa. Ciò indica che questo atto persiste e le mutazioni di fuga sono improbabili da emergere.

L'inibizione di alterazione dello schema di lettura impedisce la replica SARS-CoV-2

I ricercatori poi hanno esaminato l'effetto dell'inibitore sulla replicazione virale. Hanno trovato che il merofloxacin ha inibito la replica dalla concentrazione più bassa di μM 1,25, a cui l'efficace concentrazione mezzo massima (EC50) era μM 2,6. Quando la concentrazione nella droga è stata sollevata a μM 40 o sopra, il virus è diventato inosservabile. Il calo nel rendimento virale quasi esponenzialmente è stato collegato con l'inibizione di PRF -1. Ciò indica che la tariffa della replica del virus dipende da risparmio di temi di alterazione dello schema di lettura.

Implicazioni ed orientamenti futuri

Il FSEs dei coronaviruses è altamente efficiente e questo studio esplora la misura a cui questo attributo si riferisce ad attuabilità virale usando un inibitore recentemente identificato di alterazione dello schema di lettura. I ricercatori descrivono i risultati: “La relazione quasi-esponenziale fra il titolo virale ed il risparmio di temi di PRF −1 indica un modello semplice in cui la traduzione di ORF1b fissa il limite del tasso di accrescimento SARS-CoV-2.„

Ciò giustifica lo sviluppo degli inibitori di PRF −1 efficacemente per contrapporrsi alla crescita SARS-CoV-2 e ad altri virus a RNA dello stesso tipo di PRF. La più ricerca resta effettuare per delucidare il meccanismo di un'inibizione di PRF -1 dal merofloxacin.

Altre spiegazioni possibili

I risultati hanno potuto anche essere spiegati dalla necessità assoluta per PRF altamente efficiente di raggiungere la giusta correlazione stechiometrica fra gli enzimi del complesso della replica. La perdita di questo bilanciamento diminuendo o aumentando il risparmio di temi di PRF -1 da anche un po'urta severamente la crescita virale.

Un'altra possibilità è che le piccole riduzioni di ciascuno degli enzimi dilimitazione tradotti del complesso di replicase-transcriptase si accumulano per causare una profonda riduzione della replicazione virale.

Potrebbe essere dovuto l'associazione diretta del FSE, disturbante la stabilità dello pseudoknot e facente diminuire così fare una pausa necessario del ribosoma che è richiesto per frameshifting. Un'altra visualizzazione è che questa associazione conferisce la stabilità extra allo pseudoknot in moda da attaccare troppo lungamente i ribosomi arrivanti, si scontra o deve fare la coda, interamente disturbando il trattamento regolare dell'allungamento di traduzione.

Altre possibilità comprendono la stabilizzazione di una conformazione sbagliata di FSE, che preclude frameshifting. Tali strutture recentemente sono state dimostrate in celle infettate dal virus. Se il merofloxacin è trovato per interagire con uno o più di tali strutture improduttive, potrebbe diminuire il risparmio di temi di FSE dalla più piccola frazione risultante di RNAs produttivo.

Per concludere, il merofloxacin può agire sui fattori modulatory ospite che agiscono sull'alterazione dello schema di lettura inversa, quali i helicases del RNA ospite, che potrebbero partecipare allo spiegamento dello pseudoknot dopo il PRF -1 ma prima della continuazione della traduzione. Fluoroquinolones è conosciuto per mirare ai topoisomerases batterici del DNA. Ulteriore studio rivelerà gli enzimi analoghi negli più alti organismi, compreso gli analoghi del RNA.

Avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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