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Inibidor novo da tradução do RNA SARS-CoV-2

Enquanto a busca para o coronavirus eficaz da Síndrome Respiratória Aguda Grave 2 inibidores (SARS-CoV-2) continua, um estudo recente por pesquisadores da Faculdade de Medicina da Universidade de Yale publicou nos relatórios do bioRxiv* do server da pré-impressão em outubro de 2020 o efeito inibitório do merofloxacin da droga em frameshifting durante a réplica SARS-CoV-2. Este é um prova--conceito importante que apoie o potencial para visar PRF −1 como uma terapia antivirosa eficaz nesta pandemia assim como contra outro beta-coronaviruses.

Tradução e Frameshifting de ORF1ab

SARS-CoV-2 liga à pilha de anfitrião através de sua proteína do ponto e começa a replicate a fim estabelecer a infecção. A tradução das proteínas virais começa do fragmento de ORF1ab, que é o por muito maior, estando sobre o kb 21 por muito tempo, e a inclusão de 2/3 do todo único-encalhou o genoma.

Codifica um polyprotein, que seja fendido então em 16 proteínas nonstructural (nsp) pela acção de dois proteases. Muitas proteínas na segunda metade do jogo do polyprotein um a parte vital na transcrição viral e na réplica. Isto inclui nsp12, uma polimerase de RNA RNA-dependente (RdRp), helicase do RNA (Hel/nsp13), e um exoribonuclease de correcção, entre outros.

A tradução de ORF1b, o 3' lado de ORF1ab, exige um frameshift ocorrer em todos os coronaviruses. Quando os ribosomes alcançarem o fim de ORF1a, alguns dele necessidade de mover-se no sentido retrógrado por um nucleotide. Este é o frameshift ribosomal programado -1 (- 1 PRF).

Depois deste frameshift, continuam a traduzir o resto do ORF no quadro de leitura -1 novo até que o grande polyprotein do todo esteja traduzido. Se não, chegarão logo em um codon de parada nos 0 quadros, que terminará a tradução prematuramente. Isto desabilitará a réplica viral.

Uma tela da alto-produção identifica moduladores do PRF de SARS-CoV-2 −1.
Uma tela da alto-produção identifica moduladores do PRF de SARS-CoV-2 −1.

Estruturas do FSE

A região do PRF −1 é encontrada frequentemente para conter uma seqüência escorregadiço de 7 nucleotide (UUUAAAC em SARS-CoV-2) e uma estrutura secundária estável a jusante essa funções como um elemento deestimulação (FSE). Este último traz pausas aproximadamente breves no movimento para a frente do ribosome, reservando o momento dos tRNAs de conseguir o alinhamento correcto no que diz respeito à seqüência escorregadiço. Isto é exigido em parte para o Frameshifting Ribosomal programado -1 (PRF).

Um FSE comum é o pseudoknot do RNA. Nos SARS-CoV, SARS-CoV-2, e outros betacoronaviruses, pensa-se que talvez um pseudoknot da três-haste pode actuar como o FSE. Esta estrutura não é muito comum em mRNAs do anfitrião. É, conseqüentemente usado frequentemente para testar o efeito explicitamente de interromper a expressão genética viral, como pelas mutações e pelas drogas que inibem PRF -1.

Isto foi demonstrado na réplica do VIH, por um inibidor exógeno do PRF -1 e pelos indícios que indicam que é parte da resposta antivirosa do anfitrião.

Merofloxacin inibe a réplica SARS-CoV-2

No estudo actual, os pesquisadores identificaram o merofloxacin antibiótico do fluoroquinolone pela selecção da alto-produção para inibidores do PRF −1 de SARS-CoV-2. Mostram essa incubação com esta réplica SARS-CoV-2 suprimida composto em pilhas de Vero.

Embora o ivermectin era igualmente inibidor do PRF A-1, teve efeitos da citotoxidade, ao contrário do merofloxacin, que tem somente efeitos cytostatic modestos mesmo em níveis elevados. É um inibidor específico do PRF do betacoronavirus -1, ao contrário de outros fluoroquinolones que faltam esta actividade. Isto sugere que os grupos estruturais em determinados locais específicos possam ser responsáveis para a inibição do frameshift.

Desde que o FSE da seqüência SARS-CoV é quase idêntico àquele de SARS-CoV-2, o merofloxacin inibe 1 - frameshift em ambos quase ingualmente. A concentração inibitório metade-máxima (IC50) é o μM ~20, que é superior à inibição de 25% produzida por um outro inibidor chamado SHFL.

Merafloxacin é um inibidor específico do betacoronavirus FSEs, mas não de outros coronaviruses ou de outros vírus comuns. Outros coronaviruses sazonais têm uma estrutura mais elaborada do pseudoknot, ao contrário do pseudoknot de 3 hastes dos betacoronaviruses.

A inibição de Merofloxacin resiste mutações do escape

Os pesquisadores igualmente encontraram que a inibição merofloxacin-induzida do frameshift persiste apesar das mutações no genoma viral. Os vírus do RNA são sabidos para ter uma taxa rápida da mutação, algumas de que pode tornar o vírus resistente ao agente antiviroso. O estudo incluiu as mutações já conhecidas para existir no vírus.

Encontraram muito poucas mutações na seqüência do FSE, que deve ser esperada à vista da grande importancia de PRF -1 à réplica viral. Entre 20 mutações nesta região, nenhuma menos de 16 ocorreram somente uma vez. Dos quatro permanecendo, dois estão na haste 1, e um cada na haste 2 e 3.

Estar na haste, nenhuma destes podia conduzir a uma alteração na estrutura da três-haste do pseudoknot. Contudo, os pesquisadores encontraram que a inibição do PRF -1 pelo merofloxacin ocorreu com todas estas variações sem perda de eficácia.

Continuando destas mutações já existentes que não mudaram a estrutura do pseudoknot, exploraram então o efeito de outras mutações que perturbaram a estrutura. Encontraram que estes causaram uma redução em frameshifting por 10% a 77%, segundo seu rompimento. Uma das reduções as mais significativas foi causado por uma mutação no único uridine desirmanado, indicando que tem uma função desconhecida. Ambo esta mutação, U13485, e os seguintes G13486 são conservados completamente entre coronaviruses humanos.

Embora estas mutações geram uma vasta gama de perturbação estruturais, a inibição de frameshift produzida pelo merofloxacin que actua em todas estas variações permaneceu quase a mesma. Isto indica que esta acção persiste, e as mutações do escape são pouco susceptíveis de emergir.

A inibição do Frameshift impede a réplica SARS-CoV-2

Os pesquisadores examinaram então o efeito do inibidor na réplica viral. Encontraram que o merofloxacin inibiu a réplica da mais baixa concentração do μM 1,25, em que a concentração eficaz metade-máxima (EC50) era o μM 2,6. Quando a concentração da droga foi levantada para o μM 40 ou acima, o vírus tornou-se indetectável. A gota no rendimento viral foi relacionada quase exponencial à inibição do PRF -1. Isto indica que a taxa de réplica do vírus depende da eficiência do frameshift.

Implicações e sentidos futuros

O FSEs dos coronaviruses é altamente eficiente, e este estudo explora a medida a que este atributo se relaciona à viabilidade viral usando um inibidor recentemente identificado do frameshift. Os pesquisadores descrevem os resultados: “O relacionamento próximo-exponencial entre o titer viral e a eficiência do PRF −1 aponta a um modelo simples em que a tradução de ORF1b ajusta o limite de taxa de crescimento SARS-CoV-2.”

Isto justifica a revelação de inibidores do PRF −1 para contrariar eficazmente o crescimento SARS-CoV-2 e os outros vírus do RNA do mesmo tipo de PRF. Mais pesquisa permanece ser realizada para explicar o mecanismo de uma inibição de PRF -1 pelo merofloxacin.

Outras explicações possíveis

Os resultados podiam igualmente ser explicados pela necessidade absoluta para que o PRF altamente eficiente consiga a correlação estoiquiométrica direita entre as enzimas do complexo da réplica. A perda deste balanço reduzindo ou aumentando a eficiência de PRF -1 por mesmo impacta um pouco o crescimento viral severamente.

Uma outra possibilidade é que as reduções pequenas em cada um das enzimas delimitação traduzidas do complexo do replicase-transcriptase acumulam para causar uma redução marcada na réplica viral.

Poderia ser devido ao emperramento directo do FSE, perturbando a estabilidade do pseudoknot e diminuindo assim a pausa necessária do ribosome que é exigido frameshifting. Uma outra vista é que este emperramento confere estabilidade extra ao pseudoknot de modo que os ribosomes de chegada sejam colados demasiado por muito tempo, colide ou tem que se enfileirar, toda perturbando o processo liso do alongamento da tradução.

Outras possibilidades incluem a estabilização de uma conformação incorrecta do FSE, que impossibilite frameshifting. Tais estruturas têm sido demonstradas recentemente nas pilhas contaminadas pelo vírus. Se o merofloxacin é encontrado para interagir com as umas ou várias de tais estruturas improdutivas, poderia reduzir a eficiência do FSE pela fracção menor resultante de RNAs produtivo.

Finalmente, o merofloxacin pode actuar nos factores modulatory do anfitrião que actuam no frameshift reverso, tal como os helicases do RNA do anfitrião, que puderam participar na revelação do pseudoknot depois do PRF -1 mas antes da continuação da tradução. Fluoroquinolones é conhecido para visar topoisomerases bacterianos do ADN. Um estudo mais adicional revelará as enzimas análogas em uns organismos mais altos, incluindo analogs do RNA.

Observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

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Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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