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Nuevo inhibidor de la traslación del ARN SARS-CoV-2

A medida que la búsqueda para el coronavirus efectivo de la neumonía asiática 2 inhibidores (SARS-CoV-2) continúa, un estudio reciente de los investigadores de la Facultad de Medicina de la Universidad de Yale publicó en los partes del bioRxiv* del servidor de la prueba preliminar en octubre de 2020 el efecto inhibitorio del merofloxacin de la droga sobre frameshifting durante la réplica SARS-CoV-2. Éste es un prueba-de-concepto importante que soporta el potencial para apuntar PRF −1 como terapia antivirus efectiva en este pandémico así como contra otro beta-coronaviruses.

Traslación y Frameshifting de ORF1ab

SARS-CoV-2 ata a la célula huesped vía su proteína del pico y comienza a replegar para establecer la infección. La traslación de las proteínas virales comienza del fragmento de ORF1ab, que es el con mucho el más grande, estando sobre el kb 21 de largo, y comprendiendo 2/3 del genoma de una sola fila del conjunto.

Codifica un polyprotein, que entonces es hendido en 16 proteínas nonstructural (nsp) por la acción de dos proteasas. Muchas proteínas en la segunda mitad del juego del polyprotein a la parte vital en la transcripción y la réplica virales. Esto incluye nsp12, una polimerasa de ARN ARN-relacionada (RdRp), helicase del ARN (Hel/nsp13), y un exoribonuclease que corrige, entre otros.

La traslación de ORF1b, el 3' lado de ORF1ab, requiere un mutágeno 'frameshift' ocurrir en todos los coronaviruses. Cuando los ribosomas alcanzan el final de ORF1a, alguno de él necesidad de moverse en la dirección retrógrada por un nucleótido. Éste es el mutágeno 'frameshift' ribosomal programado -1 (- 1 PRF).

Después de este mutágeno 'frameshift', continúan traducir el descanso del ORF en el nuevo marco de lectura -1 hasta que se haya traducido el polyprotein grande del conjunto. Si no, pronto llegarán un codón de parada en los 0 marcos, que terminará la traslación prematuramente. Esto incapacitará la réplica viral.

Una pantalla de la alto-producción determina moduladores del PRF de SARS-CoV-2 −1.
Una pantalla de la alto-producción determina moduladores del PRF de SARS-CoV-2 −1.

Estructuras del FSE

La región del PRF −1 se encuentra a menudo para contener una serie resbaladiza de 7 nucleótidos (UUUAAAC en SARS-CoV-2) y una estructura secundaria estable rio abajo esa las funciones como elemento mutágeno 'frameshift'-estimulante (FSE). Este este último trae pausas alrededor de abreviadas en el movimiento hacia delante del ribosoma, dando un plazo de la época de los tRNAs de lograr la alineación correcta en cuanto a la serie resbaladiza. Esto se requiere en parte para el Frameshifting Ribosomal programado -1 (PRF).

Un FSE común es el pseudoknot del ARN. En los SARS-CoV, SARS-CoV-2, y otros betacoronaviruses, se piensa que quizás un pseudoknot del tres-vástago puede actuar como el FSE. Esta estructura no es muy común en mRNAs del ordenador principal. Es, por lo tanto de uso frecuente probar el efecto explícitamente de romper la expresión génica viral, como por las mutaciones y las drogas que inhiben PRF -1.

Esto ha sido demostrada en la réplica del VIH, por un inhibidor exógeno del PRF -1 y por las pistas que indicaban que es parte de la reacción antivirus del ordenador principal.

Merofloxacin inhibe la réplica SARS-CoV-2

En el estudio actual, los investigadores determinaron el merofloxacin antibiótico del fluoroquinolone por la investigación de la alto-producción para los inhibidores del PRF −1 de SARS-CoV-2. Muestran esa incubación con esta réplica suprimida composición SARS-CoV-2 en las células de Vero.

Aunque el ivermectin era también un inhibidor del PRF -1, tenía efectos de la citotoxicidad, a diferencia del merofloxacin, que tiene solamente efectos citoestáticos modestos incluso en los niveles. Es un inhibidor específico del PRF del betacoronavirus -1, a diferencia de otros fluoroquinolones que falten esta actividad. Esto sugiere que los grupos estructurales en ciertos sitios específicos puedan ser responsables de la inhibición del mutágeno 'frameshift'.

Puesto que el FSE de la serie SARS-CoV es casi idéntico al de SARS-CoV-2, el merofloxacin inhibe 1 - mutágeno 'frameshift' en ambos casi igualmente. La concentración inhibitoria mitad-máxima (IC50) es el μM ~20, que es superior a la inhibición del 25% producida por otro inhibidor llamado SHFL.

Merafloxacin es un inhibidor específico del betacoronavirus FSEs, pero no de otros coronaviruses o de otros virus comunes. Otros coronaviruses estacionales tienen una estructura más elaborada del pseudoknot, a diferencia del pseudoknot de 3 vástagos de los betacoronaviruses.

La inhibición de Merofloxacin resiste mutaciones del escape

Los investigadores también encontraron que la inhibición merofloxacin-inducida del mutágeno 'frameshift' persiste a pesar de mutaciones en el genoma viral. Los virus del ARN se saben para tener un régimen rápido de la mutación, algunos de los cuales pueden hacer el virus resistente al agente antivirus. El estudio incluyó las mutaciones sabidas ya para existir en el virus.

Encontraron muy pocas mutaciones en la serie del FSE, que debe ser preveída teniendo en cuenta la gran importancia de PRF -1 a la réplica viral. Entre 20 mutaciones en esta región, ninguna menos de 16 han ocurrido solamente una vez. De los cuatro restantes, dos están en el vástago 1, y uno por cada uno en el vástago 2 y 3.

El estar en el vástago, ninguno de éstos podía dar lugar a un cambio en la estructura del tres-vástago del pseudoknot. Sin embargo, los investigadores encontraron que la inhibición del PRF -1 por merofloxacin ocurrió con todas estas variantes sin la baja de la eficacia.

Procediendo de estas mutaciones ya existentes que no cambiaron la estructura del pseudoknot, entonces exploraron el efecto de otras mutaciones que perturbaron la estructura. Encontraron que éstos causaron una reducción en frameshifting por el 10% al 77%, dependiendo de su desorganización. Una de las reducciones más importantes fue causado por una mutación en la única uridina desparejada, indicando que tiene una función desconocida. Ambo esta mutación, U13485, y los G13486 siguientes se conservan totalmente entre coronaviruses humanos.

Aunque estas mutaciones generan una amplia gama de perturbaciones estructurales, la inhibición del mutágeno 'frameshift' producida por el merofloxacin que actuaba en todas estas variantes casi seguía siendo lo mismo. Esto indica que persiste esta acción, y las mutaciones del escape son poco probables de emerger.

La inhibición del mutágeno 'frameshift' impide la réplica SARS-CoV-2

Los investigadores entonces examinaron el efecto del inhibidor sobre la réplica viral. Encontraron que el merofloxacin inhibió la réplica de la concentración más inferior del μM 1,25, en la cual la concentración efectiva mitad-máxima (EC50) era el μM 2,6. Cuando la concentración de la droga fue aumentada al μM 40 o arriba, el virus llegó a ser imperceptible. La caída en rendimiento viral casi exponencial fue relacionada con la inhibición del PRF -1. Esto indica que el índice de réplica del virus depende de eficiencia del mutágeno 'frameshift'.

Implicaciones y direcciones futuras

El FSEs de coronaviruses es muy eficiente, y este estudio explora la dimensión con la cual este atributo se relaciona con la viabilidad viral usando un inhibidor nuevamente determinado del mutágeno 'frameshift'. Los investigadores describen los resultados: “El lazo cercano-exponencial entre el título viral y la eficiencia del PRF −1 apunta a un modelo simple en el cual la traslación de ORF1b establezca el límite de la tasa de crecimiento SARS-CoV-2.”

Esto alinea el revelado de los inhibidores del PRF −1 para poner efectivo el incremento SARS-CoV-2 y otros virus del ARN en contra del mismo tipo de PRF. Sigue habiendo más investigación ser realizado para aclarar el mecanismo de la inhibición de PRF -1 por merofloxacin.

Otras explicaciones posibles

Los resultados se podían también explicar por la necesidad absoluta del PRF muy eficiente de lograr la correlación estequiométrica correcta entre las enzimas del complejo de la réplica. La baja de este equilibrio reduciendo o aumentando la eficiencia de PRF -1 en incluso un poco afecta incremento viral seriamente.

Otra posibilidad es que las pequeñas reducciones en cada uno de las enzimas régimen-limitadoras traducidas del complejo del replicase-transcriptase acumulan para causar una reducción marcada en la réplica viral.

Podría ser debido al atascamiento directo del FSE, perturbando la estabilidad del pseudoknot y disminuyendo así detenerse brevemente necesario del ribosoma que se requiere para frameshifting. Otra visión es que este atascamiento consulta estabilidad extra al pseudoknot para adherir los ribosomas de llegada demasiado de largo, choca o tiene que hacer cola, todo perturbando el proceso liso de la elongación de la traslación.

Otras posibilidades incluyen la estabilización de una conformación incorrecta del FSE, que impide el frameshifting. Tales estructuras se han demostrado recientemente en las células infectadas por el virus. Si el merofloxacin se encuentra para obrar recíprocamente con uno o más de tales estructuras improductivas, podría reducir la eficiencia del FSE por la fracción más pequeña resultante de RNAs productivo.

Finalmente, el merofloxacin puede actuar en los factores modulatory del ordenador principal que actúan en el mutágeno 'frameshift' reverso, tal como helicases del ARN del ordenador principal, que pudieron participar en el despliegue del pseudoknot después del PRF -1 pero antes de la continuación de la traslación. Fluoroquinolones se conoce para apuntar topoisomerases bacterianos de la DNA. El estudio adicional revelará las enzimas análogas en organismos más altos, incluyendo análogos del ARN.

Advertencia *Important

el bioRxiv publica los partes científicos preliminares que par-no se revisan y, por lo tanto, no se deben mirar como concluyentes, conduce práctica clínica/comportamiento relativo a la salud, o tratado como información establecida.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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