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Os cientistas identificam alvos terapêuticos novos para SARS-CoV-2

Para identificar alvos terapêuticos potenciais novos para SARS-CoV-2, uma equipe dos cientistas no centro do genoma de New York, a universidade de New York, e a Faculdade de Medicina de Icahn no monte Sinai, executaram uma genoma-escala, tela da perda--função CRISPR sistematicamente ao KO todos os genes no genoma humano. A equipe examinou que as alterações genéticas fizeram a pilhas humanas do pulmão mais resistente à infecção SARS-CoV-2.

Seus resultados revelaram genes individuais e as redes reguladoras do gene no genoma humano que são exigidos por SARS-CoV-2 e que confer resistência à infecção viral quando suprimido. O estudo colaborador descreveu um vasto leque dos genes que não têm sido considerados previamente como alvos terapêuticos para SARS-CoV-2. Seu estudo foi publicado em linha pela pilha o 24 de outubro.

A fim compreender melhor os relacionamentos complexos entre o anfitrião e dependências genéticas do vírus, a equipe usou uma escala larga de métodos analíticos e experimentais para validar seus resultados. Esta aproximação integrative incluiu a edição do genoma, a único-pilha que arranjam em seqüência, a imagem lactente confocal, e análises computacionais da expressão genética e de conjunto de dados proteomic.

Os pesquisadores encontraram que estes alvos novos do gene, quando inibidos usando moléculas pequenas (drogas), a carga viral significativamente reduzida, e com algumas drogas, a dobra até 1.000. Seus resultados oferecem a introspecção nas terapias novas que podem ser eficazes em tratar COVID-19 e revelam os alvos moleculars subjacentes daquelas terapias.

“Vendo o impacto trágico de COVID-19 aqui em New York e através do mundo, nós sentimos que nós poderíamos usar o gene da alto-produção CRISPR que editamos as ferramentas que nós nos aplicamos a outras doenças para compreender o que são os genes humanos chaves exigidos pelo vírus SARS-CoV-2,” dissemos o autor co-superior do estudo, o Dr. Neville Sanjana, o membro da faculdade do núcleo no centro do genoma de New York, o professor adjunto da biologia, a universidade de New York, e o professor adjunto da neurociência e da fisiologia na Faculdade de Medicina de NYU Grossman.

Previamente, o Dr. Sanjana aplicou telas genoma-largas de CRISPR para identificar os motoristas genéticos de doenças diversas, incluindo a resistência de droga na melanoma, a falha da imunoterapia, a metástase do câncer pulmonar, a imunidade inata, desordens metabólicas inatos, e a distrofia muscular.

Para este projecto, a edição do genoma era somente um meio da equação. “Nós desenvolvemos previamente uma série de modelos da pilha humana para a infecção do coronavirus em nosso trabalho para compreender respostas imunes ao vírus. Era grande team acima com grupo de Neville para compreender e detalhada genes do anfitrião do perfil de um ângulo novo,” disse o tenOever co-superior do Dr. Benjamin do autor, o professor de Fishberg de medicina, o erudito de Icahn e o professor da microbiologia, Faculdade de Medicina de Icahn no monte Sinai.

Os conjuntos do gene conduzem a maneira

A equipe descobriu que os genes parte-classificados -- aqueles cuja a perda reduz a infecção viral substancialmente -- aglomerado em um punhado de complexos da proteína, incluindo as ATPase, Retromer vacuolar, comandante, Arp2/3, e PI3K. Muitos destes complexos da proteína são envolvidos em proteínas de tráfico a e da membrana de pilha.

Nós éramos muito satisfeitos ver genes múltiplos dentro da mesma família que parte-classificou batidas em nossa tela genoma-larga. Isto deu-nos um alto nível da confiança que estas famílias da proteína fossem cruciais ao ciclo de vida do vírus, para obter em pilhas humanas ou na réplica viral bem sucedida.”

Dr. Zharko Daniloski, autor do estudo Co-Primeiro e companheiro pos-doctoral, laboratório de Sanjana, centro do genoma de New York

Quando os pesquisadores executaram a tela de CRISPR usando pilhas humanas do pulmão, a equipe igualmente explorou se a expressão de genes exigidos do anfitrião era pulmão-específica ou expressada mais amplamente.

Entre os genes parte-classificados, somente ACE2, o receptor conhecido para ser responsável para ligar o ponto viral da proteína SARS-CoV-2, mostrado a expressão tecido-específica, com o resto das batidas superiores do gene expressadas amplamente através de muitos tecidos, sugerindo que estes mecanismos possam funcionar independente da pilha ou do tipo do tecido.

Usando dados proteomic, encontraram que diversos dos genes parte-classificados do anfitrião interagem directamente com próprias proteínas do vírus, destacando seu papel fundamental no ciclo de vida viral. A equipe igualmente analisou os genes comuns do anfitrião exigidos para outros micróbios patogénicos virais, tais como Zika ou gripe da pandemia H1N1.

Introspecções mecanicistas: Colesterol e receptors virais

Após ter terminado a tela preliminar, o grupo de pesquisadores usou diversas técnicas diferentes para validar o papel de muitos dos genes parte-classificados na infecção viral.

Usando as linha celular humanas derivadas do pulmão e de outros órgãos suscetíveis à infecção SARS-CoV-2, mediram a infecção viral após o KO do gene por CRISPR, a supressão do gene usando a interferência do RNA, ou a inibição da droga. Após a validação que estas manipulações reduziram a infecção viral, procuraram em seguida compreender os mecanismos por que a perda destes genes obstrui a infecção do coronavirus.

Usando uma tecnologia recente-revelada que acoplasse CRISPR em grande escala que edita com RNA-arranjar em seqüência da único-pilha (ECCITE-segs.), a equipe identificou essa perda de diversos resultados parte-classificados dos genes no upregulation de caminhos da biosíntese do colesterol e em um aumento no colesterol celular. Usando esta introspecção, estudaram os efeitos do amlodipine, uma droga que alterasse níveis de colesterol.

“Nós encontramos que amlodipine, um antagonista do cálcio-canal, níveis de colesterol celulares dos upregulates e obstruímos a infecção SARS-CoV-2. Desde que os estudos clínicos recentes igualmente sugeriram que os pacientes que tomam construtores do cálcio-canal tenham uma taxa de fatalidade de caso COVID-19 reduzida, um sentido futuro importante da pesquisa será iluminar mais o relacionamento entre caminhos da síntese do colesterol e SARS-CoV-2,” disse o Dr. Tristan Jordânia, um companheiro pos-doctoral no laboratório do tenOever e co-primeiro autor do estudo.

A construção em trabalhos anteriores em mutações na proteína do ponto e na entrada viral através ACE2 do receptor, a equipa de investigação igualmente perguntou se a perda de alguns genes pôde confer resistência ao coronavirus abaixando os níveis ACE2. Identificaram um gene em particular, RAB7A, que tem um grande impacto em ACE2 que trafica à membrana de pilha. Usando uma combinação de cytometry de fluxo e de microscopia confocal, a equipe mostrou que a perda de RAB7A impede a entrada viral confiscando os receptors ACE2 dentro das pilhas.

“Os tratamentos actuais para a infecção SARS-CoV-2 vão actualmente após o vírus próprio, mas ofertas deste estudo uma compreensão melhor de como os genes do anfitrião influenciam a entrada viral e permitirão avenidas novas para a descoberta terapêutica e acelerarão esperançosamente a recuperação para populações suscetíveis,” disse o Dr. Sanjana.

Source:
Journal reference:

Daniloski, Z., et al. (2020) Identification of required host factors for SARS-CoV-2 infection in human cells. Cell. doi.org/10.1016/j.cell.2020.10.030.