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Potenziale di manifestazione degli sybodies di Bispecific contro SARS-CoV-2

Come la ricerca di efficaci antivirals contro il coronavirus 2 (SARS-CoV-2) di sindrome respiratorio acuto severo continua, un nuovo studio pubblicato sul bioRxiv* della pubblicazione preliminare nel novembre 2020 discute il ruolo dei nanobodies o degli sybodies sintetici nella neutralizzazione del virus legando al suo dominio dell'ricevitore-associazione (RBD) sulla proteina della punta.

Malgrado le misure del lockdown e distanziare sociale, rimane difficile da gestire la diffusione di questo virus. Ciò è a causa del suo alto transmissibility, dell'assenza di immunità del gregge e della percentuale significativa della trasmissione asintomatica. Molti casi cessano nella morbosità o nella morte severa; oltre 1,2 milione persone universalmente già hanno perso le loro vite. È così di importanza fondamentale che sviluppiamo rapido gli efficaci trattamenti per contribuire ad attenuare l'impatto di quelli infettato. Ciò potrebbe aiutare i pazienti a recuperare ed impedire la diffusione virale se usato per trattare l'infezione asintomatica prima che infettassero ulteriore trasmissione accadessero.

I ricercatori hanno messo a fuoco sullo sviluppare un vaccino del candidato sotto forma di anticorpo monoclonale, in considerazione della natura specifica e potente di tali trattamenti. Hanno scelto di sollevare l'anticorpo contro la proteina piena della punta di prefusion piuttosto che contro il RBD depurativo perché gli studi precedenti hanno indicato che gli anticorpi hanno sollevato contro gli ultimi non mostrano la capacità di neutralizzazione di livello, come previsto.

I ricercatori hanno usato i nanobodies (che sono anticorpi del unico dominio che contengono il dominio variabile di VHH degli anticorpi del camelid) che possiedono soltanto le catene pesanti di Ig. Questi sono trovati per avere il potenziale immenso, essendo piccoli, stalla ed economico sono prodotti nei sistemi del lievito e batterici - ma per mostrare l'affinità equivalente ai loro obiettivi confrontati agli anticorpi tradizionali.

I nanobodies sintetici utilizzati in questo studio sono venuto da tre librerie progettate recentemente da questi scienziati, che sono basati sulle strutture dei complessi dell'nanobody-obiettivo. Tali sybodies - come sono chiamati - possono essere modificati per misura una proteina bersaglio data nei 12 giorni, mentre i nanobodies naturali richiedono più di due mesi da generare tramite immunizzazione ripetuta e la selezione successiva del raccoglitore.

Negli stati previsti e predefiniti attuali di studio, sono stati forniti per la selezione sybody adeguata, di modo che realmente riconoscono la conformazione della punta di prefusion. Questa capacità di scegliere i termini per la selezione è egualmente un grande vantaggio di questa tecnologia. Ed infine, le formulazioni nanobody possono essere date da inalazione, in modo da significa che questo potrebbe essere sviluppato in un modo conveniente, rapido e diretto di prevenzione.

Anbody e associazione sybody ad un epitopo conservato di RBD. Superimposion dei sistemi cristallini del frammento favoloso umano CR3022 (identificazione del crossreacve an-SARS-CoV-1 di PDB: 6W41) ed il frammento favoloso umano EY6A (identificazione di PDB: 6ZCZ), entrambi i risoluti nel complesso con SARS-CoV-2 RBD, con i modelli di omologia degli sybodies Sb#15 e Sb#68 collocati nella mappa cryo-EM del conformaon simmetrico della punta 3up. Le strutture sono indicate di superficie e sono colorate come indicato.
Anbody e associazione sybody ad un epitopo conservato di RBD. Superimposion dei sistemi cristallini del frammento favoloso umano CR3022 (identificazione del crossreacve an-SARS-CoV-1 di PDB: 6W41) ed il frammento favoloso umano EY6A (identificazione di PDB: 6ZCZ), entrambi i risoluti nel complesso con SARS-CoV-2 RBD, con i modelli di omologia degli sybodies Sb#15 e Sb#68 collocati nella mappa cryo-EM del conformaon simmetrico della punta 3up. Le strutture sono indicate di superficie e sono colorate come indicato.

Generazione e caratterizzazione di Sybody

I ricercatori hanno identificato un insieme di 63 sybodies che legano due epitopi distinti al RBD. C'era diversità enorme nei raccoglitori generati durante la ricerca da tre istituti differenti. Questi poi sono stati schermati per facilità della caratterizzazione, in base alle loro funzionalità biochimiche. Per concludere, dei 57 sybodies adatti a caratterizzazione, hanno trovato sei sybodies con forte affinità per il RBD.

Tuttavia, quasi tutti gli 57 sybodies efficacemente hanno inibito l'associazione di RBD al ricevitore dell'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2). Ma mentre la maggior parte di loro hanno raggiunto un rapporto di riproduzione di 50% in associazione di RBD, associazione quasi completamente neutralizzata cinque. Questi fa parte del sei citato più presto e “potevano quasi interamente abolire l'interazione fra RBD e hACE2.„

Associazione simultanea delle paia sybody a RBD

I sei raccoglitori di promessa erano Sb#14, Sb#15, Sb#16, Sb#42, Sb#45 e Sb#68. Tuttavia, hanno trovato che una volta incubata con Sb#68, la proteina della punta potrebbe ancora legare potente a Sb#15. Ciò non potrebbe accadere se fosse preincubata con c'è ne degli altri.

I ricercatori hanno considerato questo come prova che sia Sb#68 che Sb#15 legano simultaneamente alla punta. Ciò è stata confermata dagli studi supplementari facendo uso di S-2P e di S-6P, rispettivamente, che sono altamente moduli stabilizzati della punta di prefusion. Quando la punta integrale è stata provata, i due sybodies sono stati conosciuti per legare in cooperazione, a differenza del RBD depurativo.

Inoltre, hanno trovato che quando questi due sybodies sono stati iniettati insieme, l'associazione ACE2 è stata inibita forte tramite l'associazione non Xerox. Infatti, Sb#68 ha sopra una più forte affinità composta di dieci parti per lo S-2P stabilizzato riguardante il RBD da solo.

Sb#14 e Sb#15 sono stati trovati per inibire efficientemente l'associazione al ricevitore virale.

Neutralizzazione di SARS-CoV-2

Determinato, soltanto gli sybodies di alto-affinità (Sb#14 e Sb#15) hanno mostrato l'alta neutralizzazione di SARS-CoV-2 pseudotyped. Una volta fuse ai domini umani di IgG1 Fc, le costruzioni hanno mostrato l'avidità molto maggior, probabilmente dovuto la presentazione bivalente degli sybodies sui domini di Fc. Il guadagno più significativo era con Sb#16, mentre era piccolo con Sb#68, indicante un effetto epitopo-dipendente.

Quando sia Sb#15 che Sb#68 sono stati utilizzati in un paio, hanno mostrato l'abilità di neutralizzazione potente. Ciò indica il loro additivo potenziale o attività di neutralizzazione sinergica.

Le paia degli sybodies, di Sb#15 e di Sb#68 hanno mostrato la capacità potente di neutralizzare l'entrata sia dello pseudotyped di che il wildtype SARS-CoV-2, comunque gli ultimi più di meno è stato tracciato.

Bispecific sybody

I ricercatori poi hanno costruito tre organismi, composti di Sb#15 e di Sb#68 collegati da una sequenza flessibile del linker di GGGGS con i numeri varianti delle ripetizioni, 2 - 6, chiamato GS2, GS4 e GS6. Hanno trovato che questi sybodies bispecific hanno avuti affinità molto più alta dell'associazione sopra i diversi sybodies.

Hanno concluso simultaneamente, “i due sybodies della legatura fusa della costruzione alla proteina della punta, quindi con conseguente forte effetto di avidità.„

Il loro effetto di neutralizzazione era egualmente molto più alto, circa da un cento-popolare confrontato ai diversi sybodies.

Studio obbligatorio sugli sybodies fusi dal Cryo-EM

I ricercatori poi hanno esaminato esclusivamente la struttura della punta Sb#15, della punta Sb#68, o dei complessi sybody della punta-bispecific, secondo il cryo-EM. I precedenti due erano a risoluzione bassa ma servito a definire la posizione generale degli epitopi obbligatori sul RBD. Sb#15 e Sb#68 sono stati veduti per legare alla cima del RBD, sovrapponentesi forte con la sede del legame ACE2 ed al lato del RBD, ad un epitopo conservato e distinto che è sepolto “giù„ nella conformazione. L'epitopo Sb#68 ha causato l'ostacolo sterico all'associazione ACE2 e questo può essere perché questo sybody può non Xerox inibire ACE2.

Tuttavia, l'ultimo è stato veduto in due conformazioni differenti. Nel primo, indicato circa da un terzo delle particelle, la simmetria era tripla. I tre RBDs erano in “„ su conformazione ed ogni due sybodies rilegati, mostranti l'associazione simultanea di Sb#15 e di Sb#68.

Nel secondo, indicato da un quinto delle particelle, la conformazione trimeric della punta era insolita, essendo asimmetrica, con un RBD che è nel “su,„ uno “nel up-out„ ed uno in “giù„ posiziona. In questo scenario, la punta è stata limitata a tre Sb#15 ed a due Sb#68.

Di questi, Sb#15 e Sb#68 sono stati limitati ad uno “„ su RBD come nella prima conformazione. “Giù„ I RBD limitano soltanto Sb#15, ma questo ha spinto quello terzo su e fuori. Quindi, questo ha impedito l'asse triplo di simmetria. Il terzo “up-out„ RBD limita entrambi gli sybodies, ma Sb#68 ha mostrato la densità debole.

La stessa conformazione era egualmente presente con il complesso spike/Sb#15, che conferma che questo è responsabile della mancanza dell'asse triplo di simmetria. Quindi, i 3 sullo stato possono essere raggiunti soltanto se entrambi gli sybodies sono limitati nella sinergia.

Il complesso di Sb#68/spike ha mostrato che due “„ su RBDs limitano allo sybody, ma il terzo RBD ha mostrato la densità debole. Forse questo era perché è intrinsecamente molto flessibile, che lo rende duro visualizzare. Se nell'un RBD “su„ e il down di due RBDs, Sb#68 manca dell'accesso all'epitopo a causa dell'ostacolo sterico dal RBD vicino.

Il meccanismo da cui gli sybodies fusi causano la neutralizzazione non è chiaro. Può essere dal mimetismo del ricevitore, con cui legando dalle cause degli sybodies la punta da spostarsi alla conformazione di post-fusione prima che leghi al ricevitore ACE2. Poiché questo è un evento irreversibile, ostacola l'entrata virale.

Un'altra possibilità è che gli sybodies accelerano appena i trattamenti spontanei di inattivazione della punta. Di nuovo, dato che questo paio degli sybodies lega a due epitopi distinti, non può essere suscettibile delle mutazioni di fuga.

I molti vantaggi degli sybodies così rendono questo 'una piattaforma robusta per generare le biomolecole multi-specifiche altamente potenti contro i coronaviruses.„ La natura rapida della selezione sybody, lo sviluppo e la caratterizzazione dimostrano il potenziale di questa piattaforma per le risposte abbreviate alle pandemie future.

Avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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