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Potencial da mostra dos sybodies de Bispecific contra SARS-CoV-2

Como a busca para antivirais eficazes contra o coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2) continua, um estudo novo publicado no bioRxiv* da pré-impressão discute em novembro de 2020 o papel de nanobodies ou de sybodies sintéticos em neutralizar o vírus ligando a seu domínio receptor-obrigatório (RBD) na proteína do ponto.

Apesar das medidas do lockdown e de afastar-se social, permanece difícil controlar a propagação deste vírus. Isto é devido a seu transmissibility alto, à ausência de imunidade do rebanho, e à porcentagem significativa da transmissão assintomática. Muitos casos terminam na morbosidade ou na morte severa; sobre 1,2 milhão indivíduos no mundo inteiro têm perdido já suas vidas. É assim imperativo que nós desenvolvemos ràpida tratamentos eficazes para ajudar a abrandar o impacto daqueles contaminado. Isto poderia ajudar pacientes a recuperar e impedir a propagação viral se usado para tratar a infecção assintomática antes que contaminem uma transmissão mais adicional ocorressem.

Os pesquisadores centraram-se sobre desenvolver uma vacina do candidato sob a forma de um anticorpo monoclonal, em virtude da natureza específica e poderoso de tais tratamentos. Escolheram aumentar um pouco o anticorpo contra a proteína completa do ponto do prefusion do que contra o RBD refinado porque os estudos precedentes mostraram que os anticorpos aumentaram contra os últimos não mostram a capacidade de neutralização da elevação, como esperado.

Os pesquisadores usaram os nanobodies (que são anticorpos do único-domínio que contêm o domínio variável de VHH de anticorpos do camelid) que possuem somente as correntes pesadas de Ig. Estes são encontrados para ter o potencial imenso, sendo pequenos, o estábulo e produzidos barata em sistemas bacterianos e do fermento - no entanto para mostrar a afinidade equivalente a seus alvos comparados aos anticorpos tradicionais.

Os nanobodies sintéticos usados neste estudo vieram de três bibliotecas projetadas recentemente por estes cientistas, que são baseados nas estruturas de complexos do nanobody-alvo. Tais sybodies - como são chamados - podem ser alterados para caber uma proteína dada do alvo no prazo de 12 dias, visto que os nanobodies naturais tomam mais de dois meses a ser gerados pela imunização repetida e pela selecção subseqüente da pasta.

Nas condições de planeamento e predefinidas actuais do estudo, foram fornecidos para a selecção sybody apropriada, de modo que reconhecessem realmente a conformação do ponto do prefusion. Esta capacidade para escolher as condições para a selecção é igualmente uma vantagem grande desta tecnologia. E última, as formulações nanobody podem ser dadas pela inalação, assim que significa que este poderia ser desenvolvido em um modo conveniente, rápido e directo de prevenção.

Anbody e emperramento sybody a um resumo conservado de RBD. Superimposion das estruturas de cristal do fragmento fabuloso humano CR3022 do crossreacve an-SARS-CoV-1 (identificação do PDB: 6W41) e o fragmento fabuloso humano EY6A (identificação do PDB: 6ZCZ), ambos os determinados no complexo com SARS-CoV-2 RBD, com modelos da homologia dos sybodies Sb#15 e Sb#68 colocados no mapa cryo-EM do conformaon simétrico do ponto 3up. As estruturas são mostradas tão de superfície e coloridas como indicado.
Anbody e emperramento sybody a um resumo conservado de RBD. Superimposion das estruturas de cristal do fragmento fabuloso humano CR3022 do crossreacve an-SARS-CoV-1 (identificação do PDB: 6W41) e o fragmento fabuloso humano EY6A (identificação do PDB: 6ZCZ), ambos os determinados no complexo com SARS-CoV-2 RBD, com modelos da homologia dos sybodies Sb#15 e Sb#68 colocados no mapa cryo-EM do conformaon simétrico do ponto 3up. As estruturas são mostradas tão de superfície e coloridas como indicado.

Geração e caracterização de Sybody

Os pesquisadores identificaram um grupo de 63 sybodies que ligam dois resumos distintos no RBD. Havia uma diversidade enorme nas pastas geradas durante a busca por três institutos diferentes. Estes foram seleccionados então para a facilidade da caracterização, com base em suas características bioquímicas. Finalmente, dos 57 sybodies apropriados para a caracterização, encontraram seis sybodies com afinidade forte para o RBD.

Contudo, quase todos os 57 sybodies inibiram eficazmente o emperramento de RBD ao receptor deconversão da enzima 2 (ACE2). Mas quando a maioria deles conseguiram uma redução a 50% no emperramento de RBD, emperramento cinco quase completamente neutralizado. Estas eram parte do seis mencionado mais cedo e “podia quase inteiramente abulir a interacção entre RBD e hACE2.”

Emperramento simultâneo de pares sybody a RBD

As seis pastas prometedoras eram Sb#14, Sb#15, Sb#16, Sb#42, Sb#45, e Sb#68. Contudo, encontraram que quando incubada com Sb#68, a proteína do ponto poderia ainda ligar poderosa a Sb#15. Isto não poderia ocorrer se preincubated com os alguns dos outro.

Os pesquisadores consideraram este ser evidência que Sb#68 e Sb#15 ligam ao ponto simultaneamente. Isto foi confirmado por estudos adicionais usando S-2P e S-6P, respectivamente, que são altamente formulários estabilizados do ponto do prefusion. Quando o ponto completo foi testado, os dois sybodies foram sabidos para ligar cooperativa, ao contrário do RBD refinado.

Além disso, encontraram que quando estes dois sybodies foram injectados junto, o emperramento ACE2 estêve inibido fortemente pelo emperramento competitivo. De facto, Sb#68 tem sobre uma afinidade mais forte da dez-dobra para o S-2P estabilizado relativo ao RBD apenas.

Sb#14 e Sb#15 foram encontrados para inibir eficientemente o emperramento ao receptor viral.

Neutralização de SARS-CoV-2

Individualmente, somente os sybodies da alto-afinidade (Sb#14 e Sb#15) mostraram a neutralização alta de SARS-CoV-2 pseudotyped. Quando fundidas aos domínios humanos de IgG1 Fc, as construções mostraram a avidez muito maior, provavelmente devido à apresentação bivalente dos sybodies nos domínios de Fc. O ganho o mais significativo era com o Sb#16, quando era pequeno com Sb#68, indicando um efeito resumo-dependente.

Quando Sb#15 e Sb#68 foram usados em um par, mostraram a capacidade de neutralização poderoso. Isto indica sua aditivo potencial ou actividade de neutralização sinérgico.

Os pares de sybodies, de Sb#15 e de Sb#68 mostraram a capacidade para neutralizar poderosa a entrada do pseudotyped e o wildtype SARS-CoV-2, os últimos foi marcado embora menos.

Bispecific sybody

Os pesquisadores construíram então três corpos, compo de Sb#15 e de Sb#68 ligados por uma seqüência flexível do linker de GGGGS com os números de variação de repetições, 2 a 6, chamado GS2, GS4 e GS6. Encontraram que estes sybodies bispecific tiveram uma afinidade muito mais alta da ligação sobre os sybodies individuais.

Concluíram, “os dois sybodies do ligamento fundido da construção simultaneamente à proteína do ponto, desse modo tendo por resultado um efeito forte da avidez.”

Seu efeito de neutralização era igualmente muito mais alto, aproximadamente por um de cem vezes comparado aos sybodies individuais.

Estudo obrigatório de sybodies fundidos pelo Cryo-EM

Os pesquisadores examinaram então a estrutura do ponto Sb#15, do ponto Sb#68, ou de complexos sybody do ponto-bispecific separada, pelo cryo-EM. Os dois anteriores estavam na baixa definição mas servido para atribuir o lugar geral dos resumos obrigatórios no RBD. Sb#15 e Sb#68 foram vistos para ligar à parte superior do RBD, sobrepor fortemente com o local ACE2 obrigatório, e ao lado do RBD, a um resumo conservado e distinto que fosse enterrado “para baixo” na conformação. O resumo Sb#68 causou o obstáculo steric ao emperramento ACE2 e este pode ser porque este sybody pode competitiva inibir ACE2.

Contudo, o último foi considerado em duas conformações diferentes. No primeiro, mostrado aproximadamente por um terço das partículas, a simetria era triplo. Os três RBDs estavam no “acima” da conformação, e cada os dois sybodies encadernados, mostrando o emperramento simultâneo de Sb#15 e de Sb#68.

No segundo, mostrado por um quinto das partículas, a conformação trimeric do ponto era incomum, sendo assimétrica, com o um RBD que está no “acima,” um no “up-out” e um no “para baixo” posiciona. Nesta encenação, o ponto foi limitado a três Sb#15 e a dois Sb#68.

Destes, Sb#15 e Sb#68 foram limitados a um “acima” de RBD como na primeira conformação. “Para baixo” Os RBD limitam somente Sb#15, mas este empurrou terceiro acima e para fora. Assim, isto impediu a linha central triplo da simetria. O terceiro “up-out” RBD limita ambos os sybodies, mas Sb#68 mostrou a densidade fraca.

A mesma conformação estava igualmente actual com o complexo spike/Sb#15, que confirma que este é responsável para a falta da linha central triplo da simetria. Assim, os 3 acima do estado podem ser conseguidos somente se ambos os sybodies são limitados na sinergia.

O complexo de Sb#68/spike mostrou que dois “acima” de RBDs limitam ao sybody, mas o terceiro RBD mostrou a densidade fraca. Talvez isto era porque é intrìnseca muito flexível, que faz duro visualizar. Se no um RBD “acima de” e o down de dois RBDs, Sb#68 falta o acesso ao resumo devido ao obstáculo steric pelo RBD vizinho.

O mecanismo por que os sybodies fundidos causam a neutralização não é claro. Pode ser pelo mimetismo do receptor, por meio de que ligando por causas dos sybodies o ponto a deslocar à conformação da cargo-fusão antes que ligue ao receptor ACE2. Desde que este é um evento irreversível, impede a entrada viral.

Uma outra possibilidade é que os sybodies apenas aceleram processos espontâneos da inactivação do ponto. Além disso, dado que este par de sybodies liga a dois resumos distintos, não pode ser suscetível às mutações do escape.

Muitas vantagens dos sybodies fazem assim a isto 'uma plataforma robusta para gerar biomoléculas multi-específicas altamente poderosos contra coronaviruses.” A natureza rápida da selecção sybody, a revelação, e a caracterização demonstram o potencial desta plataforma para respostas rápidos às pandemias futuras.

Observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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