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Potencial de la demostración de los sybodies de Bispecific contra SARS-CoV-2

Como la búsqueda para los antivirals efectivos contra el coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de la neumonía asiática continúa, un nuevo estudio publicado en el bioRxiv* de la prueba preliminar discute en noviembre de 2020 el papel de nanobodies o de sybodies sintetizados en la neutralización del virus atando a su dominio receptor-obligatorio (RBD) en la proteína del pico.

A pesar de dimensiones del lockdown y la distancia social, sigue siendo difícil controlar la extensión de este virus. Esto está debido a su alta transmisibilidad, la ausencia de inmunidad de la manada, y el porcentaje importante de la transmisión asintomática. Muchos casos terminan en morbosidad o muerte severa; sobre 1,2 millones de individuos por todo el mundo han perdido ya sus vidas. Es así imprescindible que desarrollamos rápidamente tratamientos efectivos para ayudar a atenuar el impacto de ésos infectado. Esto podría ayudar a pacientes a recuperar y a prevenir la extensión viral si estuvo utilizada para tratar la infección asintomática antes de que infecten la transmisión adicional ocurran.

Los investigadores se centraron en desarrollar una vacuna del candidato bajo la forma de anticuerpo monoclonal, debido a la naturaleza específica y potente de tales tratamientos. Eligieron aumentar el anticuerpo contra la proteína completa del pico del prefusion bastante que contra el RBD purificado porque los estudios anteriores han mostrado que los anticuerpos aumentaron contra estes último no muestran capacidad de neutralización del alto, como se esperaba.

Los investigadores utilizaron los nanobodies (que son anticuerpos del único-dominio que contienen el dominio variable de VHH de los anticuerpos del camelid) que poseían solamente las cadenas pesadas de Ig. Éstos se encuentran para tener potencial inmenso, siendo pequeños, establo y se producen barato en sistemas bacterianos y de la levadura - pero para mostrar afinidad equivalente a sus objetivos comparados a los anticuerpos tradicionales.

Los nanobodies sintetizados usados en este estudio vinieron a partir de tres bibliotecas diseñadas recientemente por estos científicos, que se basan en las estructuras de los complejos del nanobody-objetivo. Tales sybodies - que se llaman - se pueden modificar para ajustar una proteína dada del objetivo en el plazo de 12 días, mientras que los nanobodies naturales tardan más de dos meses que se generarán por la inmunización relanzada y la selección subsiguiente del aglutinante.

En las condiciones previstas y predefinidas actuales del estudio, fueron ofrecidos para la selección sybody apropiada, de modo que reconozcan real la conformación del pico del prefusion. Esta capacidad de elegir las condiciones para la selección es también una ventaja grande de esta tecnología. Y pasado, las formulaciones nanobody se pueden dar por la inhalación, así que significa que esto se podría desarrollar en una manera conveniente, rápida y directa de la prevención.

Anbody y atascamiento sybody a un epitopo conservado de RBD. Superimposion de las estructuras cristalinas del fragmento fabuloso humano CR3022 (identificación del crossreacve an-SARS-CoV-1 del PDB: 6W41) y el fragmento fabuloso humano EY6A (identificación del PDB: 6ZCZ), ambos resueltos en complejo con SARS-CoV-2 RBD, con los modelos de la homología de los sybodies Sb#15 y Sb#68 colocados en el mapa cryo-EM del conformaon simétrico del pico 3up. Las estructuras se muestran tan superficial y se colorean como indicado.
Anbody y atascamiento sybody a un epitopo conservado de RBD. Superimposion de las estructuras cristalinas del fragmento fabuloso humano CR3022 (identificación del crossreacve an-SARS-CoV-1 del PDB: 6W41) y el fragmento fabuloso humano EY6A (identificación del PDB: 6ZCZ), ambos resueltos en complejo con SARS-CoV-2 RBD, con los modelos de la homología de los sybodies Sb#15 y Sb#68 colocados en el mapa cryo-EM del conformaon simétrico del pico 3up. Las estructuras se muestran tan superficial y se colorean como indicado.

Generación y caracterización de Sybody

Los investigadores determinaron un equipo de 63 sybodies que atan dos epitopos distintos en el RBD. Había diversidad enorme en los aglutinantes generados durante la búsqueda por tres diversos institutos. Éstos entonces fueron revisados para la facilidad de la caracterización, sobre la base de sus características bioquímicas. Finalmente, de los 57 sybodies convenientes para la caracterización, encontraron seis sybodies con la afinidad fuerte para el RBD.

Sin embargo, casi todos los 57 sybodies inhibieron efectivo el atascamiento de RBD al receptor de la enzima angiotensina-que convertía 2 (ACE2). Pero mientras que la mayor parte de lograron una reducción del 50% en el atascamiento de RBD, atascamiento casi totalmente neutralizado cinco. Éstos eran parte del seis mencionado anterior y “podía casi totalmente suprimir la acción recíproca entre RBD y hACE2.”

Atascamiento simultáneo de pares sybody a RBD

Los seis aglutinantes prometedores eran Sb#14, Sb#15, Sb#16, Sb#42, Sb#45, y Sb#68. Sin embargo, encontraron que cuando estaba incubada con Sb#68, la proteína del pico podría todavía atar potente a Sb#15. Esto no podría ocurrir si fue preincubada con otros uces de los.

Los investigadores consideraban esto ser pruebas que Sb#68 y Sb#15 atan al pico simultáneamente. Esto fue confirmada por estudios adicionales usando S-2P y S-6P, respectivamente, que son altamente formas estabilizadas del pico del prefusion. Cuando el pico integral fue probado, los dos sybodies eran sabidos para atar cooperativamente, a diferencia del RBD purificado.

Por otra parte, encontraron que cuando estos dos sybodies fueron inyectados juntos, el atascamiento ACE2 fue inhibido fuertemente por el atascamiento competitivo. De hecho, Sb#68 tiene sobre una afinidad más fuerte décupla para el S-2P estabilizado en relación con el RBD solamente.

Sb#14 y Sb#15 fueron encontrados para inhibir el atascamiento al receptor viral eficientemente.

Neutralización de SARS-CoV-2

Individualmente, solamente los sybodies de la alto-afinidad (Sb#14 y Sb#15) mostraron la alta neutralización de SARS-CoV-2 pseudotyped. Cuando estaban fundidas a los dominios humanos de IgG1 Fc, las construcciones mostraron la avidez mucho mayor, probablemente debido a la presentación bivalente de los sybodies en los dominios de Fc. El avance más importante estaba con Sb#16, mientras que era pequeño con Sb#68, indicando un efecto epitopo-relacionado.

Cuando Sb#15 y Sb#68 fueron utilizados en un par, mostraron capacidad de neutralización potente. Esto indica su añadido potencial o actividad de neutralización sinérgica.

Los pares de sybodies, de Sb#15 y de Sb#68 mostraron la capacidad potente de neutralizar el asiento de pseudotyped y el wildtype SARS-CoV-2, aunque estes último fue marcado menos.

Bispecific sybody

Los investigadores entonces construyeron tres carrocerías, compuestas de Sb#15 y de Sb#68 conectados por una serie flexible de la máquina para hacer chorizos de GGGGS a números diversos de repeticiones, a partir el 2 a 6, llamado GS2, GS4 y GS6. Encontraron que estos sybodies bispecific tenían afinidad mucho más alta de atar sobre los sybodies individuales.

Concluyeron, “los dos sybodies del lazo fundido de la construcción simultáneamente a la proteína del pico, de tal modo dando por resultado un efecto fuerte de la avidez.”

Su efecto de neutralización era también mucho más alto, por alrededor de un de cien veces comparada a los sybodies individuales.

Estudio obligatorio de sybodies fundidos por el Cryo-EM

Los investigadores entonces examinaron la estructura del pico Sb#15, del pico Sb#68, o de los complejos sybody del pico-bispecific por separado, por el cryo-EM. Los dos anteriores estaban en la resolución inferior pero servido destinar la situación general de los epitopos obligatorios en el RBD. Sb#15 y Sb#68 fueron vistos para atar a la capota del RBD, recubriendo fuertemente con el punto de enlace ACE2, y al lado del RBD, a un epitopo conservado y distinto que se sotierra en “hacia abajo” la conformación. El epitopo Sb#68 causó obstáculo estérico al atascamiento ACE2 y éste puede ser porqué este sybody puede competitivo inhibir ACE2.

Sin embargo, este último fue considerado en dos diversas conformaciones. En el primer, mostrado por alrededor de un tercero de las partículas, la simetría era triple. Los tres RBDs estaban en “encima” de la conformación, y cada los dos sybodies encuadernados, mostrando el atascamiento simultáneo de Sb#15 y de Sb#68.

En el segundo, mostrado por un quinto de las partículas, la conformación trímera del pico era inusual, siendo asimétrica, con un RBD estando en “hacia arriba,” uno en el “up-out” y uno en “hacia abajo” coloca. En este decorado, el pico estuvo limitado a tres Sb#15 y a dos Sb#68.

De éstos, Sb#15 y Sb#68 estuvieron limitados a uno “encima” de RBD como en la primera conformación. “Hacia abajo” Los RBD limitan solamente Sb#15, pero éste activó tercer hacia arriba y fuera. Así, esto previno el eje triple de la simetría. El tercer “up-out” RBD limita ambos sybodies, pero Sb#68 mostró densidad débil.

La misma conformación estaba también presente con el complejo spike/Sb#15, que confirma que éste es responsable de la falta del eje triple de la simetría. Así, los 3 encima de estado pueden ser logrados solamente si ambos sybodies están limitados en sinergia.

El complejo de Sb#68/spike mostró que dos “encima” de RBDs limitan al sybody, pero el tercer RBD mostró densidad débil. Quizás esto estaba porque es intrínseco muy flexible, que hace duro visualizar. Si en el un RBD “encima de” y el down de dos RBDs, Sb#68 falta el acceso al epitopo debido a obstáculo estérico por el RBD vecino.

El mecanismo por el cual los sybodies fundidos causan la neutralización no está sin obstrucción. Puede estar por la mímica del receptor, por el que ata por causas de los sybodies el pico a cambio a la conformación de la poste-fusión antes de que ate al receptor ACE2. Puesto que esto es una acción irreversible, obstaculiza el asiento viral.

Otra posibilidad es que los sybodies apenas aceleran procesos espontáneos de la desactivación del pico. Una vez más dado que este par de sybodies ata a dos epitopos distintos, puede no ser susceptible a las mutaciones del escape.

Las muchas ventajas de sybodies así hacen esto 'una plataforma robusta para generar biomoléculas multi-específicas altamente potentes contra coronaviruses.” La naturaleza rápida de la selección sybody, el revelado, y la caracterización demuestran el potencial de esta plataforma para las reacciones por vía rápida a los pandémicos futuros.

Advertencia *Important

el bioRxiv publica los partes científicos preliminares que par-no se revisan y, por lo tanto, no se deben mirar como concluyentes, conduce práctica clínica/comportamiento relativo a la salud, o tratado como información establecida.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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