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Dépistage sans fioritures rapide de SARS-CoV-2 en salive avec LAMP-Cas13

Pendant que la pandémie de la maladie 2019 (COVID 19) de coronavirus continue à exercer son influence au-dessus du monde, des méthodes d'essai rapides pour le dépistage de l'ARN sont instamment exigées pour le contrôle de la maladie.

Un papier neuf qui est apparu comme un prétirage sur le serveur de medRxiv* décrit en décembre 2020 un test acide nucléique validé sur la salive échantillonne. En principe, ce test emploie l'amplification d'acide nucléique viral avec le dépistage suivant de Cas13-mediated, en combination avec le lysis d'échantillon par les réactifs bons marchés solides sur l'étagère, sans besoin d'extraction d'ARN.

Schéma de l

Schéma de l'échantillon DISCoVER pour répondre au flux de travail. Crédit d'image :

Ce test a la sensibilité et la spécificité élevées et peut être employé avec les sondes multiples de CRISPR pour trouver un gène humain ou d'autres agents pathogènes avec le virus d'objectif. Appelé découvrez (diagnose avec l'enregistrement enzymatique de coronavirus), ceci est un test SARS-CoV-2 qui n'exige pas l'extraction d'ARN. En cela, il est à la différence d'autres tests basés sur CRISPR comme DETECTR et STOPCovid V2 qui emploient le VOYANT et le Cas12.

Deuxièmement, découvrez évite l'échantillon des voies aériennes supérieures, en étant basé sur des spécimens de salive. L'utilisation des échantillons de salive a été décrite, pour éviter des contacts de travailleur-patient de santé. Ceux-ci sont conformes aux écouvillons nasopharyngaux dans 97% de cas une fois vérifiés par la réaction en chaîne inverse de transcriptase-polymérase (Droite-qPCR).

Défis dans le qPCR normal

Après l'infection avec le syndrôme respiratoire aigu sévère coronavirus-1 (SARS-CoV-2), il y a une phase asymptomatique où les répliques de virus dans les cellules hôte infectées et s'écarte à d'autres parties des poumons et des cellules ciliées de la voie aérienne nasale. Pendant la phase suivante, la production virale devient exponentielle et la personne devient infectieuse, bien que souvent asymptomatique ou presymptomatic.

Une fois que la phase symptomatique règle dedans, la charge virale dans les voies aériennes supérieures tombe habituellement de sa crête, et les régimes de la positivité d'acide nucléique sont également inférieurs. Puisque c'est la phase si maximum des régimes de contrôle sont observées, beaucoup de tests sont susceptibles de renvoyer des résultats faussement positifs.

D'ailleurs, les tests normaux tels que l'ACP quantitatif (qPCR) exigent les installations sophistiquées, personnel qualifié, et prennent du temps. Le long temps requis pour qu'un résultat de test soit retourné rend ces tests inappropriés pour la diagnose de POC.

Besoin de tests rapides de POC

La plupart de moyen efficace de briser le réseau de la boîte de vitesses est par le contrôle régulier utilisant le contrôle rapide (POC) de remarque-de-soins aux courts délais. De nouveau, le contrôle rapide pourrait être employé pour recenser les positifs au niveau communautaire, qui sont confirmés par des tests plus spécifiques après le transfert.

Troisièmement, ayant plus d'une ou quelque méthodes de contrôle ont pu éviter des goulots d'étranglement dans le réseau diagnostique d'alimentation en fournissant les nécessaires alternatifs d'échantillonnage et de contrôle.

Les premiers chercheurs ont développé les analyses qui emploient le qPCR sans extraction précédente d'ARN, avec le lysis de la chaleur de l'échantillon. Des agents de Chaotropic, les inhibiteurs de RNAase, et les agents réducteurs ont été également employés.

Vérifiez les principes

le dépistage basé sur CRISPR et l'amplification isotherme sont des méthodes qui peuvent être combinées avec le lysis et l'échantillonnage directs de salive pour le test diagnostique de POC. le dépistage CRISPR-assisté de l'ARN viral dépend de l'utilisation de l'ARN de guide d'activer Cas13 ou Cas12, qui sont des nucleases. Ces enzymes activées obtiennent des nucleases non spécifiques contre l'ARN (ss) monocatenaire ou l'ADN, de ce fait fendant une molécule attachée de journaliste et activant son desserrage. Le dépistage de ce journaliste fournit alors la lecture de test.

L'avantage du contrôle basé sur CRISPR est sa spécificité élevée. Cependant, l'utilisation seuls des nucleases Cas13 peut retarder la sensibilité attomolar par jusqu'à deux heures. Pour surmonter ceci, elles ont employé l'amplification isotherme boucle-assistée (VOYANT), qui est rapid et extrêmement sensible, prenant moins de 20 mn pour le dépistage à la sensibilité attomolar.

Avec le VOYANT, le premier ARN viral inverse-est transcrit à l'ADN utilisant une combinaison de transcriptase inverse, d'une boucle déplaçant l'ADN polymérase, et de trois paires d'amorce. L'ADN est alors soumis au VOYANT.

Dans l'étude actuelle, des promoteurs de polymérase ARN ont été intégrés dans les amorces de VOYANT, de sorte que l'ADN amplifié ait pu être transcrit à l'ARN monocatenaire, qui est identifié par la sonde Cas13. Ceci a comme conséquence l'amplification de VOYANT à l'ARN ou au rLAMP. Puisque chaque produit de VOYANT sera transcrit par la polymérase ARN dès que formé, le signe Cas13 fait une pointe en minutes <five, respectivement. Sa limite de dépistage (LOD) est attomolar.

Dans l'expérience actuelle, ils ont exploré neuf ensembles d'amorces de VOYANT qui ont été dirigées à différentes régions en travers du génome de SARS-CoV-2 et ont constaté que tous les signes positifs produits quand ils ont visé l'ARN génomique à 100 copies/µL. La fluorescence a fait une pointe dans un délai de 20 mn, et pour trois des jeux, dans un délai de 15 mn.

Cette technique, cependant, exige la rectification pour l'amplification non spécifique, probablement le résultat de la dimérisation d'amorce. Cette rectification a été fournie à l'aide d'une sonde du détail Cas13 pour identifier particulièrement l'acide nucléique amplifié, ainsi la sensibilité de couplage avec la spécificité.

Les chercheurs ont choisi le N règlent 1 d'amorces, qui identifie SARS-CoV-2 le gène du nucleocapsid (n), parce qu'il a un temps inférieur au seuil et parce que son amplicon est assez grand pour s'adapter dans l'ARN du guide Cas13. Le N a réglé 1 jeu d'amorce a un LOD de 25 copies/µL.

Quelles sont les implications ?

L'étude actuelle décrit ainsi une combinaison exceptionnelle de deux mécanismes d'amplification, amplifiant la sensibilité du test, avec une sonde Cas13 pour la spécificité. L'amplification de VOYANT prend 20-30 mn.

L'utilisation des réactifs courants, peu coûteux, et facilement procurables pour le lysis direct à la température ambiante simplifie la procédure. Les chercheurs précisent que la facilité et le confort du ramassage de salive pour le contrôle COVID-19 aboutiront probablement à un contrôle plus élevé des régimes et à un contrôle plus fréquent, y compris le contrôle asymptomatique. C'est parce que les échantillons de salive ont des titres viraux comparables contre des écouvillons de voies aériennes supérieures. Cependant, ce dernier peuvent également être employés avec le flux de travail de découverte.

L'étude valide le dépistage de SARS-CoV-2 sur une modification basée sur salive témoin, utilisant un virus sous tension, parallèlement à un gène humain comme contrôle. D'ailleurs, la capacité d'employer différents acides nucléiques active son adaptation pour le dépistage d'un grand choix d'agents pathogènes tels que la grippe A et B.

L'utilisation de la salive, du dépistage sans extraction d'ARN, et du potentiel pour le dépistage multiplex d'objectif lui transforme un excellent candidat pour le développement en tests diagnostique de POC pour COVID-19.

Davantage d'intégration avec une plate-forme et un dispositif de dépistage microfluidic facilitera le contrôle fréquent pour des écoles et des lieux de travail en tant qu'élément d'une infrastructure robuste pour le contrôle universel. »

Avis *Important

le medRxiv publie les états scientifiques préliminaires qui pair-ne sont pas observés et ne devraient pas, en conséquence, être considérés comme concluants, guident la pratique clinique/comportement relatif à la santé, ou traité en tant qu'information déterminée.

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