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Tempestiva rilevazione senza fronzoli di SARS-CoV-2 in saliva con LAMP-Cas13

Mentre la pandemia di malattia 2019 (COVID 19) di coronavirus continua ad esercitare la sua influenza sopra il mondo, i metodi di collaudo rapidi per la rilevazione di RNA sono richiesti urgentemente per sorveglianza di malattia.

Un nuovo documento che è comparso come una pubblicazione preliminare sul " server " del medRxiv* nel dicembre 2020 descrive una prova acida nucleica convalidata sulla saliva campiona. In linea di principio, questa prova usa l'amplificazione virale dell'acido nucleico con rilevazione successiva di Cas13-mediated, congiuntamente a lisi del campione dai reagenti a basso costo scaffale-stabili, senza l'esigenza dell'estrazione del RNA.

Disegno schematico del campione DISCoVER per rispondere al flusso di lavoro

Disegno schematico del campione DISCoVER per rispondere al flusso di lavoro. Credito di immagine:

Questa prova ha l'alte sensibilità e specificità e può essere usata con le sonde multiple di CRISPR per individuare un gene umano o altri agenti patogeni con il virus dell'obiettivo. Chiamato scopra (sistemi diagnostici con la segnalazione enzimatica di Coronavirus), questo è una prova SARS-CoV-2 che non richiede l'estrazione del RNA. In questo, è a differenza di altre a prove basate CRISPR come DETECTR e STOPCovid V2 che usano la LAMPADA e Cas12.

Secondariamente, scopra evita il campionamento delle vie respiratorie superiori, essendo basando sugli esemplari della saliva. L'uso dei campioni della saliva è stato descritto, per evitare i contatti del lavoratore-paziente di sanità. Questi sono d'accordo con i tamponi rinofaringei in 97% dei casi una volta provati da reazione a catena della transcriptase-polimerasi inversa (RT-qPCR).

Sfide nel qPCR standard

A seguito dell'infezione con la sindrome respiratorio acuto severo coronavirus-1 (SARS-CoV-2), c'è una fase asintomatica dove le repliche del virus all'interno delle cellule ospiti infettate e si sparge ad altre parti dei polmoni e delle celle ciliate delle vie respiratorie nasali. Nella fase prossima, la produzione virale diventa esponenziale e la persona diventa contagiosa, sebbene spesso asintomatico o presintomatico.

Una volta che la fase sintomatica colloca dentro, il caricamento virale nelle vie respiratorie superiori sta cadendo solitamente dal suo picco e le tariffe della positività dell'acido nucleico sono corrispondentemente più basse. Poiché questa è la fase una volta massima tariffe di prova è osservata, molte prove sono probabili restituire i risultati erroneamente positivi.

Inoltre, le prove standard quale la PCR quantitativa (qPCR) richiedono gli impianti specializzati, il personale formato e richiedono tempo. Il molto tempo richiesto affinchè un risultato dei test sia rinviato rende queste prove inadatte per i sistemi diagnostici di POC.

Esigenza delle prove rapide di POC

La maggior parte del modo efficace di rompere la catena di trasmissione è dalla prova regolare facendo uso della prova rapida (POC) di punto-de-cura ad intervalli brevi. Di nuovo, la prova rapida potrebbe essere usata per identificare i positivi al livello comunitario, che sono confermati dalle prove più specifiche dopo il rinvio.

In terzo luogo, avendo più di un o alcun metodo di prova ha potuto impedire i gravi ostacoli nella rete diagnostica dell'offerta fornendo i kit alternativi di prova e di campionatura.

I ricercatori più in anticipo hanno sviluppato le analisi che usano il qPCR senza estrazione precedente del RNA, con lisi del calore del campione. Gli agenti di Chaotropic, gli inibitori di RNAase e gli agenti riduttori egualmente sono stati usati.

Verifichi i principi

a rilevazione basata CRISPR e l'amplificazione isotermica sono metodi che possono combinarsi con lisi diretta e la campionatura della saliva per la prova diagnostica di POC. la rilevazione CRISPR-mediata di RNA virale dipende dall'uso del RNA della guida attivare Cas13 o Cas12, di cui tutt'e due sono nucleases. Questi enzimi attivati suscitano i nucleases non specifici contro RNA (ss) o DNA unico incagliato, così fendendo una molecola rilegata del reporter e permettendo alla sua versione. La rilevazione di questo reporter poi fornisce la lettura della prova.

Il vantaggio alla della prova basata CRISPR è la sua alta specificità. Tuttavia, l'uso dei nucleases Cas13 da solo può ritardare la sensibilità attomolar entro fino a due ore. Per sormontare questa, hanno usato l'amplificazione isotermica ciclo-mediata (LAMPADA), che è sia rapida che altamente sensibile, richiedente meno di 20 minuti per rilevazione alla sensibilità attomolar.

Con la LAMPADA, il primo RNA virale inverso-è trascritto a DNA facendo uso di una combinazione di transcriptase inverso, di filo che spostano la DNA polimerasi e di tre paia della mano di fondo. Il DNA poi è sottoposto alla LAMPADA.

Nello studio corrente, i promotori del RNA polimerasi sono stati integrati nelle mani di fondo della LAMPADA, di modo che il DNA ampliato ha potuto essere trascritto a RNA unico incagliato, che è riconosciuto dalla sonda Cas13. Ciò provoca l'amplificazione della LAMPADA a RNA o a rLAMP. Poiché ogni prodotto della LAMPADA è trascritto dal RNA polimerasi non appena formato, il segnale Cas13 alza nei minuti <five, rispettivamente. Il suo limite di rilevazione (LOD) è attomolar.

Nell'esperimento corrente, hanno esplorato nove insiemi delle mani di fondo della LAMPADA che sono state dirette alle regioni differenti attraverso il genoma di SARS-CoV-2 ed hanno trovato che tutti i segnali positivi prodotti quando hanno mirato al RNA genomica a 100 copies/µL. La fluorescenza ha alzato in 20 minuti e per tre degli insiemi, in 15 minuti.

Questa tecnica, tuttavia, richiede la correzione per l'amplificazione non specifica, possibilmente il risultato della dimerizzazione della mano di fondo. Questa correzione è stata fornita usando una sonda specifica Cas13 specificamente per riconoscere l'acido nucleico ampliato, così la sensibilità dell'accoppiamento con la specificità.

I ricercatori hanno scelto N collocano 1 delle mani di fondo, che riconosce SARS-CoV-2 il gene del nucleocapsid (n), sia perché ha un tempo basso alla soglia che perché il suo amplicon è abbastanza grande andare d'accordo il RNA della guida Cas13. N ha collocato 1 insieme della mano di fondo ha un LOD di 25 copies/µL.

Che cosa sono le implicazioni?

Lo studio corrente descrive così una combinazione insolita di due meccanismi di amplificazione, amplificante la sensibilità della prova, con una sonda Cas13 per la specificità. L'amplificazione della LAMPADA richiede 20-30 minuti.

L'uso dei reagenti comuni, economici e disponibili per lisi diretta alla temperatura ambiente semplifica facilmente la procedura. I ricercatori precisano che la facilità e la comodità della raccolta della saliva per la prova COVID-19 probabilmente piombo all'più alta prova le tariffe ed alla prova più frequente, compreso la prova asintomatica. Ciò è perché i campioni della saliva hanno titoli virali comparabili contro i tamponi superiori della galleria di ventilazione. Tuttavia, gli ultimi possono anche essere usati con il flusso di lavoro di scoperta.

Lo studio convalida la rilevazione di SARS-CoV-2 ad una su una matrice basata a saliva del campione, facendo uso di un virus in tensione, in parallelo con un gene umano come controllo. Inoltre, la capacità di usare gli acidi nucleici differenti permette al suo adattamento per la rilevazione di vari agenti patogeni quale influenza A e B.

L'uso della saliva, della rilevazione senza estrazione del RNA e del potenziale per rilevazione multipla dell'obiettivo gli trasforma un candidato eccellente per lo sviluppo un test diagnostico di POC per COVID-19.

Ulteriore integrazione con una piattaforma e un'unità di rilevazione microfluidic faciliterà la frequente prova per i banchi ed i posti di lavoro come componente di un'infrastruttura robusta per sorveglianza pandemica.„

Avviso *Important

il medRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

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