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Detecção rápida dos nenhum-folhos de SARS-CoV-2 na saliva com LAMP-Cas13

Enquanto a pandemia da doença 2019 do coronavirus (COVID 19) continua a exercer sua influência sobre o mundo, os métodos de teste rápidos para a detecção de RNA estão exigidos urgente para a fiscalização da doença.

Um papel novo que apareça como uma pré-impressão no server do medRxiv* descreve em dezembro de 2020 um teste ácido nucleico validado na saliva prova. Em princípio, este teste usa a amplificação viral do ácido nucleico com detecção subseqüente de Cas13-mediated, em combinação com o lysis da amostra por reagentes baratos prateleira-estáveis, sem a necessidade para a extracção do RNA.

Diagrama esquemático da amostra DISCoVER para responder a trabalhos

Diagrama esquemático da amostra DISCoVER para responder a trabalhos. Crédito de imagem:

Este teste tem a sensibilidade e a especificidade altas e pode ser usado com pontas de prova múltiplas de CRISPR para detectar um gene humano ou outros micróbios patogénicos junto com o vírus do alvo. Chamado descubra (diagnósticos com o relatório enzimático de Coronavirus), isto é um teste SARS-CoV-2 que não exija a extracção do RNA. Nisto, é ao contrário de outro testes CRISPR-baseados como DETECTR e STOPCovid V2 que usam a LÂMPADA e o Cas12.

Em segundo lugar, descubra evita a preparação de amostras da via aérea superior, sendo baseado em espécimes da saliva. O uso de amostras da saliva foi descrito, para evitar contactos do trabalhador-paciente dos cuidados médicos. Estes concordam com os cotonetes nasopharyngeal em 97% dos casos quando testados pela reacção em cadeia reversa da transcriptase-polimerase (RT-qPCR).

Desafios no qPCR padrão

Depois da infecção com a Síndrome Respiratória Aguda Grave coronavirus-1 (SARS-CoV-2), há uma fase assintomática onde os replicates do vírus dentro das pilhas de anfitrião contaminadas e espalha a outras partes dos pulmões e das pilhas ciliated da via aérea nasal. Na próxima fase, a produção viral torna-se exponencial e o indivíduo torna-se infeccioso, embora frequentemente assintomático ou presymptomatic.

Uma vez que a fase sintomático se ajusta dentro, a carga viral na via aérea superior está caindo geralmente de seu pico, e as taxas de positividade do ácido nucleico são correspondentemente mais baixas. Desde que esta é a fase quando máxima taxas do teste é observada, muitos testes são prováveis retornar resultados do falso positivo.

Além disso, os testes padrão tais como PCR quantitativo (qPCR) exigem facilidades sofisticadas, pessoais treinados, e tomam o tempo. Os muitos tempos exigidos para que um resultado da análise seja retornado fazem estes testes inoportunos para diagnósticos do POC.

Necessidade para testes rápidos do POC

A maioria de maneira eficaz de quebrar a corrente da transmissão é pelo teste regular usando o teste rápido (POC) do ponto--cuidado em intervalos curtos. Além disso, o teste rápido poderia ser usado para identificar os positivos a nível comunitário, que são confirmados por uns testes mais específicos depois da referência.

Em terceiro lugar, tendo mais de um ou algum método do teste podia impedir gargalos na rede diagnóstica da fonte fornecendo jogos alternativos da amostra e do teste.

Uns pesquisadores mais adiantados desenvolveram os ensaios que usam o qPCR sem extracção precedente do RNA, com lysis do calor da amostra. Os agentes de Chaotropic, os inibidores de RNAase, e os agentes de diminuição foram usados igualmente.

Teste princípios

a detecção CRISPR-baseada e a amplificação isothermal são os métodos que podem ser combinados com o lysis e a amostra directos da saliva para o teste diagnóstico do POC. a detecção CRISPR-negociada de RNA viral depende do uso do RNA do guia activar Cas13 ou Cas12, ambo são nucleases. Estas enzimas ativadas induzem nucleases não específicos contra o RNA (ss) ou o ADN único-encalhado, assim fendendo uma molécula encadernada do repórter e permitindo sua liberação. A detecção deste repórter fornece então o readout do teste.

A vantagem do teste CRISPR-baseado é sua especificidade alta. Contudo, o uso dos nucleases Cas13 apenas pode atrasar a sensibilidade attomolar em até duas horas. Para superar esta, usaram a amplificação isothermal laço-negociada (LÂMPADA), que é rapid e altamente sensível, tomando menos de 20 minutos para a detecção na sensibilidade attomolar.

Com LÂMPADA, o primeiro RNA viral reverso-é transcrito ao ADN usando uma combinação de transcriptase reverso, de uma costa que deslocam a polimerase de ADN, e de três pares da primeira demão. O ADN é sujeitado então à LÂMPADA.

No estudo actual, os promotores da polimerase de RNA foram integrados nas primeiras demão da LÂMPADA, de modo que o ADN amplificado pudesse ser transcrito ao RNA único-encalhado, que é reconhecido pela ponta de prova Cas13. Isto conduz à amplificação da LÂMPADA ao RNA ou ao rLAMP. Desde que cada produto da LÂMPADA é transcrito pela polimerase de RNA assim que formado, o sinal Cas13 repica em actas <five, respectivamente. Seu limite de detecção (LOD) é attomolar.

Na experiência actual, exploraram nove grupos de primeiras demão da LÂMPADA que foram dirigidas em regiões diferentes através do genoma de SARS-CoV-2 e encontraram que todos os sinais positivos produzidos quando visaram o RNA genomic em 100 copies/µL. A fluorescência repicou dentro de 20 minutos, e para três dos grupos, dentro de 15 minutos.

Esta técnica, contudo, exige a correcção para a amplificação não específica, possivelmente o resultado do dimerization da primeira demão. Esta correcção foi fornecida usando uma ponta de prova Cas13 específica para reconhecer especificamente o ácido nucleico amplificado, assim a sensibilidade do acoplamento com especificidade.

Os pesquisadores escolheram o N ajustam 1 das primeiras demão, que reconhece o nucleocapsid SARS-CoV-2 (N) gene, porque tem uma baixa estadia ao ponto inicial e porque seu amplicon é grande bastante caber no RNA do guia Cas13. O N ajustou 1 grupo da primeira demão tem um LOD de 25 copies/µL.

Que são as implicações?

O estudo actual descreve assim uma combinação incomum de dois mecanismos da amplificação, impulsionando a sensibilidade do teste, com uma ponta de prova Cas13 para a especificidade. A amplificação da LÂMPADA toma 20-30 minutos.

O uso de reagentes comuns, baratos, e facilmente disponíveis para o lysis directo na temperatura ambiente simplifica o procedimento. Os pesquisadores indicam que a facilidade e o conforto da coleção da saliva para o teste COVID-19 conduzirão provavelmente a um teste mais alto taxas e a um teste mais freqüente, incluindo o teste assintomático. Isto é porque as amostras da saliva têm titers virais comparáveis contra cotonetes superiores da via aérea. Contudo, os últimos podem igualmente ser usados com os trabalhos da descoberta.

O estudo valida a detecção de SARS-CoV-2 em uma matriz saliva-baseada da amostra, usando um vírus vivo, paralelamente a um gene humano como um controle. Além disso, a capacidade para usar ácidos nucleicos diferentes permite sua adaptação para a detecção de uma variedade de micróbios patogénicos tais como a gripe A e B.

O uso da saliva, da detecção extracção-livre do RNA, e do potencial para a detecção multiplex do alvo faz-lhe um candidato excelente para a revelação em um teste de diagnóstico do POC para COVID-19.

Uma integração mais adicional com uma plataforma e um dispositivo de detecção microfluidic facilitará o teste freqüente para escolas e locais de trabalho como parte de uma infra-estrutura robusta para a fiscalização pandémica.”

Observação *Important

o medRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

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