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Detección rápida de los ninguno-volantes de SARS-CoV-2 en saliva con LAMP-Cas13

A medida que el pandémico de la enfermedad 2019 (COVID 19) del coronavirus continúa ejercer su influencia sobre el mundo, los métodos de pruebas rápidos para la detección del ARN se requieren urgente para la vigilancia de la enfermedad.

Un nuevo papel que apareció como una prueba preliminar en el servidor del medRxiv* describe en diciembre de 2020 una prueba ácida nucléica validada en la saliva muestrea. En principio, esta prueba utiliza la amplificación viral del ácido nucléico con la detección subsiguiente de Cas13-mediated, conjuntamente con lisis de la muestra por los reactivos baratos saliente-estables, sin la necesidad de la extracción del ARN.

Diagrama esquemático de la muestra DISCoVER para contestar a flujo de trabajo

Diagrama esquemático de la muestra DISCoVER para contestar a flujo de trabajo. Haber de imagen:

Esta prueba tiene altas sensibilidad y especificidad y se puede utilizar con las antenas múltiples de CRISPR para descubrir un gen humano u otros patógeno junto con el virus del objetivo. Llamado descubra (los diagnósticos con la información enzimática de Coronavirus), esto es una prueba SARS-CoV-2 que no requiere la extracción del ARN. En esto, es a diferencia de otro pruebas CRISPR-basadas como DETECTR y STOPCovid V2 que utilicen la LÁMPARA y Cas12.

En segundo lugar, descubra evita el muestreo de la aerovía superior, siendo basado en especímenes de la saliva. El uso de las muestras de la saliva se ha descrito, para evitar contactos del trabajador-paciente de la atención sanitaria. Éstos están de acuerdo con los lampazos nasofaríngeos en el 97% de casos cuando son probada por la reacción en cadena reversa de la transcriptase-polimerasa (RT-qPCR).

Retos en qPCR estándar

Después de la infección con la neumonía asiática coronavirus-1 (SARS-CoV-2), hay una fase asintomática donde las réplicas del virus dentro de las células huesped infectadas y se extiende a otras partes de los pulmones y de las células ciliated de la aerovía nasal. En la fase próxima, la producción viral llega a ser exponencial y el individuo hace infeccioso, aunque a menudo asintomático o presintomático.

Una vez que la fase sintomática fija hacia adentro, la carga viral en la aerovía superior está cayendo generalmente de su pico, y los índices de positividad del ácido nucléico son correspondientemente más inferiores. Puesto que se observa ésta es la fase cuando es máxima los regímenes de la prueba, muchas pruebas son probables volver resultados falso-positivos.

Por otra parte, las pruebas estándar tales como polimerización en cadena cuantitativa (qPCR) requieren las instalaciones sofisticadas, personales entrenados, y las toman tiempo. El tiempo largo requerido para que un resultado de la prueba sea vuelto hace estas pruebas inadecuadas para los diagnósticos del PC.

Necesidad de pruebas rápidas del PC

La mayoría del modo eficaz de romper la cadena de la transmisión está por la prueba regular usando la prueba rápida (POC) del punto-de-cuidado en los intervalos cortos. Una vez más la prueba rápida se podría utilizar para determinar los positivos en el nivel de comunidad, que son confirmados por pruebas más específicas después de la remisión.

En tercer lugar, teniendo más de un o algún métodos de prueba podían prevenir atascamientos en la red diagnóstica del abastecimiento ofreciendo estuches alternativos del muestreo y de la prueba.

Investigadores anteriores han desarrollado los análisis que utilizan el qPCR sin la extracción anterior del ARN, con la lisis del calor de la muestra. Los agentes de Chaotropic, los inhibidores de RNAase, y los reductores también se han utilizado.

Pruebe los principios

la detección CRISPR-basada y la amplificación isotérmica son los métodos que se pueden combinar con lisis y el muestreo directos de la saliva para la prueba diagnóstica del PC. la detección CRISPR-mediada del ARN viral depende del uso del ARN de la guía de activar Cas13 o Cas12, que son nucleases. Estas enzimas activadas sacan nucleases no específicos contra el ARN (ss) o la DNA de una sola fila, así hendiendo una molécula encuadernada del reportero y habilitando su baja. La detección de este reportero entonces ofrece la lectura de la prueba.

La ventaja de la prueba CRISPR-basada es su alta especificidad. Sin embargo, el uso de los nucleases Cas13 solamente puede demorar sensibilidad attomolar por hasta dos horas. Para vencer esto, utilizaron la amplificación isotérmica rizo-mediada (LÁMPARA), que es rapid y altamente sensible, tardando menos de 20 minutos para la detección en la sensibilidad attomolar.

Con la LÁMPARA, el primer ARN viral reverso-se transcribe a la DNA usando una combinación del transcriptase reverso, de un cabo que disloca la polimerasa de DNA, y de tres pares de la pintura de fondo. La DNA entonces se sujeta a la LÁMPARA.

En el estudio actual, los promotores de la polimerasa de ARN eran integrados en las pinturas de fondo de la LÁMPARA, de modo que la DNA amplificada se pudiera transcribir al ARN de una sola fila, que es reconocido por la antena Cas13. Esto da lugar a la amplificación de la LÁMPARA al ARN o al rLAMP. Puesto que cada producto de la LÁMPARA es transcrito por la polimerasa de ARN tan pronto como esté formado, la señal Cas13 enarbola en minutos <five, respectivamente. Su límite de detección (LOD) es attomolar.

En el experimento actual, exploraron nueve equipos de las pinturas de fondo de la LÁMPARA que fueron dirigidas en diversas regiones a través del genoma de SARS-CoV-2 y encontraron que todas las señales positivas producidas cuando apuntaron el ARN genomic en 100 copies/µL. La fluorescencia enarboló en el plazo de 20 minutos, y para tres de los equipos, en el plazo de 15 minutos.

Esta técnica, sin embargo, requiere la corrección para la amplificación no específica, posiblemente el resultado de la dimerización de la pintura de fondo. Esta corrección fue ofrecida usando una antena específica Cas13 para reconocer específicamente el ácido nucléico amplificado, así la sensibilidad del acoplamiento con especificidad.

Los investigadores eligieron la N fijan 1 de pinturas de fondo, que reconoce SARS-CoV-2 el gen del nucleocapsid (n), porque tiene un rato inferior al umbral y porque su amplicon es bastante grande ajustar en el ARN de la guía Cas13. La N fijó 1 equipo de la pintura de fondo tiene un LOD de 25 copies/µL.

¿Cuáles son las implicaciones?

El estudio actual describe así una combinación inusual de dos mecanismos de la amplificación, reforzando la sensibilidad de la prueba, con una antena Cas13 para la especificidad. La amplificación de la LÁMPARA tarda 20-30 minutos.

El uso de los reactivos comunes, baratos, y disponibles para la lisis directa en la temperatura ambiente simplifica fácilmente el procedimiento. Los investigadores señalan que la facilidad y la comodidad de la colección de la saliva para la prueba COVID-19 llevarán probablemente a una prueba más alta regímenes y a una prueba más frecuente, incluyendo la prueba asintomática. Esto es porque las muestras de la saliva tienen títulos virales comparables comparado con los lampazos superiores de la aerovía. Sin embargo, estes último se pueden también utilizar con el flujo de trabajo del descubrimiento.

El estudio valida la detección de SARS-CoV-2 en una matriz saliva-basada de la muestra, usando un virus vivo, paralelamente a un gen humano como mando. Por otra parte, la capacidad de utilizar diversos ácidos nucléicos habilita su adaptación para la detección de una variedad de patógeno tales como gripe A y B.

El uso de la saliva, de la detección extracción-libre del ARN, y del potencial para la detección múltiplex del objetivo le hace a un candidato excelente al revelado en una prueba diagnóstica del PC para COVID-19.

La integración adicional con una plataforma y un dispositivo de detección microfluidic facilitará la prueba frecuente para las escuelas y los lugares de trabajo como parte de una infraestructura robusta para la vigilancia pandémica.”

Advertencia *Important

el medRxiv publica los partes científicos preliminares que par-no se revisan y, por lo tanto, no se deben mirar como concluyentes, conduce práctica clínica/comportamiento relativo a la salud, o tratado como información establecida.

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