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Les chercheurs développent un petit prix, analyse salive-optimisée de RT-LAMP pour un dépistage plus rapide de SARS-CoV-2

La pandémie du coronavirus 2 de syndrôme respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2) a mis en valeur les points faibles dans la réaction de secours mondial et a piloté une demande massive des technologies in vitro de test diagnostique.

Étude : Développement d
Étude : Développement d'une analyse salive-optimisée de RT-LAMP pour SARS-CoV-2. Crédit d'image : Sdecoret/Shutterstock

La technologie en temps réel quantitative d'amplification en chaîne par polymérase (qPCR) est très utilisée comme tests diagnostique pour le dépistage SARS-CoV-2, mais elle n'accomplit pas de façon optimale les besoins diagnostiques de grande puissance de cette pandémie globale sans précédent. Les longs temps de retournement, la complexité, les manques de chaîne logistique, et le coût élevé sont quelques désavantages de Droite-qPCR qui diminuent son rendement et les accessoires lourds atteignent au contrôle.

Beaucoup de pays s'adaptent à et des technologies moléculaires se développantes pour surmonter ces points faibles. La technologie isotherme boucle-assistée de l'amplification de transcription inverse (RT-LAMP) est l'un d'entre eux et peut être une alternative viable à la technologie de qPCR en satisfaisant les besoins diagnostiques de la pandémie COVID-19.

La technique de RT-LAMP et son principe

Le VOYANT est une technique de dépistage qui travaille au même principe d'amplification d'acide nucléique que l'ACP. Cependant, le VOYANT est une technologie isotherme et n'a pas besoin de cyclers thermiques, qui coûtent plusieurs milliers de dollars. Par conséquent, RT-LAMP utilise le matériel minimal comparé à Droite-qPCR et est une meilleure alternative aux méthodes d'essai actuel utilisées.

Le contrôle de VOYANT exige au moins 4 (et jusqu'6) aux amorces différentes, dont 2 contiennent une région auto-complémentaire qui produit une boucle monocatenaire perpétuelle et 2 visez la région dans la structure de boucle monocatenaire. Ainsi, le VOYANT peut produire des quantités détectables d'ADN dans presque le même temps que l'ACP mais à l'une température unique de réaction. Le dépistage d'ADN peut être réalisé par l'intermédiaire de différentes méthodes telles que la turbidité ou à l'aide d'une teinture fluorescente.

Les efforts de dépistage plus tôt se sont concentrés sur employer le dépistage colorimétrique des produits d'amplification utilisant une teinture de pH, ou un indicateur de magnésium. Les changements de couleur produits par ces teintures, bien qu'adéquats, ont limité le contraste visible et peuvent souvent être ambigus.

La violette d'abat-jour offre une meilleure clarté visuelle et limite l'ambiguïté

Afin d'aborder les éditions ci-dessus, les chercheurs des USA utilisés récemment le pH neuf colorent la violette d'abat-jour (LSV) dans RT-LAMP. LSV a un meilleur contraste visuel entre élevés et de pH faible et une remarque plus intense d'inflexion, qui activent l'évaluation facile des résultats et réduisent l'ambiguïté. Leur étude a été publiée sur le serveur de prétirage, medRxiv*.

Pour le dépistage de SARS-CoV-2, les chercheurs ont employé la salive comme spécimen respiratoire au lieu des écouvillons nasopharyngaux. L'échantillonnage de salive est comparé beaucoup plus facile à rassembler les écouvillons nasopharyngaux. Les études précédentes ont confirmé la compatibilité de la salive avec RT-LAMP vérifiant même faute de purification d'ARN. L'équipe a ajouté une opération d'inactivation qui normalise le pH, inactive RNases, et relâche l'ARN. Cependant, puisque la salive est hétérogène dans différentes personnes, une stratégie taille unique d'inactivation n'est pas possible.

Nos résultats d'optimisation de purification proposent également plusieurs sens encore inconnus pour la future diagnose basée sur salive d'acide nucléique. »

Ainsi, ils ont optimisé un protocole d'inactivation avec une meilleure réussite en travers des échantillons hétérogènes de salive combinés avec la violette d'abat-jour. Ils ont développé un protocole mn de purification de 10 ARNs de la salive et l'ont nommé protocole magnétique SalivaBeads de talon. Ils ont également développé un bâton magnétique (MS), StickLAMP, qui offre la purification talon talon fiable d'ARN et l'accès simple et bon marché au contrôle des spécimens de salive.

La « milliseconde a également plusieurs avantages par rapport à l'autre méthode traditionnelle de séparation de talon, purification magnétique de crémaillère. »

Plusieurs caractéristiques de la purification de SalivaBeads. (a) Une comparaison d
Plusieurs caractéristiques de la purification de SalivaBeads. (a) Une comparaison d'uniformité de couleur d'échantillon de préincubation dans 12 échantillons, avec des réactions de SARS-CoV-2 et d'actine côte à côte. L'entrée directe de la salive inactivée dans une réaction basée sur rouge de phénol commercial est comparée à l'ARN SalivaBeads-épuré entré dans notre réaction violette Violet d'abat-jour. (b) Une comparaison de l'ARN SARS-CoV-2 récupéré des échantillons conçus de salive par le qPCR N1, mesuré par le nombre de copies récupéré par le qPCR divisé par le nombre de copies conçu en salive. (c) Une comparaison visuelle de limite de saletés aux magnétique-talons en isolant des talons par la crémaillère magnétique (gauche) ou un bâton magnétique (droit). (d) Une comparaison de sensibilité entre SalivaBeads a épuré par l'intermédiaire de la crémaillère magnétique (est parti) et du bâton magnétique (droit), par RT-LAMP avec la violette d'abat-jour.

Protocoles bons marchés idéaux pour des endroits d'inférieur-moyen luttant pour contenir l'écart de SARS-CoV-2

Selon les auteurs, les protocoles du dépistage SARS-CoV-2 qu'ils ont développés sont rentables, à moins que $5/test sans factoriser dans le travail et l'échantillon mettant en commun, et ils fournissent une meilleure évolutivité comparée aux protocoles existants sans affecter la sensibilité des tests. Les auteurs ont ajouté que les protocoles neufs sont idéaux pour des écoles ou des lieux de travail avec un nombre restreint de stagiaires ou d'employés de l'ordre de moins de 10 aux milliers inférieurs. Le coût bas des protocoles neufs les rend adaptés pour les environnements d'inférieur-moyen et de mal desservi qui ont été d'une façon disproportionnée affectés par la pandémie SARS-CoV-2.

Les besoins et le coût bas en équipment minimaux les rendent également bien adaptés pour les environnements inférieurs de moyen, qui pourraient encore pouvoir monter un laboratoire moyen de la complexité CLIA. »

Avis *Important

le medRxiv publie les états scientifiques préliminaires qui pair-ne sont pas observés et ne devraient pas, en conséquence, être considérés comme concluants, guident la pratique clinique/comportement relatif à la santé, ou traité en tant qu'information déterminée.

Journal reference:
Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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