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I ricercatori sviluppano un'analisi a basso costo e saliva-ottimizzata di RT-LAMP per rilevazione più veloce di SARS-CoV-2

La pandemia di coronavirus 2 di sindrome respiratorio acuto severo (SARS-CoV-2) ha evidenziato le imperfezioni nella risposta di emergenza globalmente ed ha determinato una domanda massiccia delle tecnologie diagnostiche in vitro di prova.

Studio: Sviluppo di un
Studio: Sviluppo di un'analisi saliva-ottimizzata di RT-LAMP per SARS-CoV-2. Credito di immagine: Sdecoret/Shutterstock

La tecnologia in tempo reale quantitativa di reazione a catena della polimerasi (qPCR) sta essendo ampiamente usata come test diagnostico per rilevazione SARS-CoV-2, ma non compie ottimamente i bisogni diagnostici su grande scala di questa pandemia globale senza precedenti. I molti tempi di ritorno, la complessità, le scarsità della catena di fornitura e l'alto costo sono alcuni svantaggi del RT-qPCR che fanno diminuire il suo risparmio di temi ed i panieri accedono a alle prove.

Molti paesi stanno adattando a e le tecnologie molecolari di sviluppo per sormontare queste imperfezioni. La tecnologia isotermica di amplificazione ciclo-mediata trascrizione inversa (RT-LAMP) è un di loro e può essere un'alternativa fattibile alla tecnologia del qPCR nel rispondere ai bisogni diagnostici della pandemia COVID-19.

La tecnica di RT-LAMP ed il suo principio

La LAMPADA è una tecnica di rilevazione che lavora allo stesso principio di amplificazione dell'acido nucleico della PCR. Tuttavia, la LAMPADA è una tecnologia isotermica e non ha bisogno dei cyclers termici, che costino parecchie migliaia di dollari. Quindi, RT-LAMP utilizza la strumentazione minima confrontata al RT-qPC'ed è una migliore alternativa ai metodi di collaudo corrente usati.

La prova della LAMPADA richiede almeno 4 (e fino 6) alle mani di fondo differenti, di cui 2 contengono una regione auto-complementare che produce un ciclo unico incagliato perpetuo e 2 miri alla regione nella struttura di ciclo unico incagliata. Quindi, la LAMPADA può produrre gli importi rilevabili di DNA quasi nello stesso tempo della PCR ma all'una singola temperatura della reazione. La rilevazione del DNA può essere raggiunta via i metodi differenti quale torbidezza o usando una tintura fluorescente.

Gli sforzi di individuazione tempestiva hanno messo a fuoco usando sulla rilevazione colorimetrica dei prodotti di amplificazione facendo uso di una tintura di pH, o su un indicatore del magnesio. I cambiamenti di colore prodotti da queste tinture, sebbene adeguati, abbiano limitato il contrasto visibile e possono spesso essere ambigui.

La viola del paralume offre la migliore chiarezza e limita l'ambiguità

Per affrontare le emissioni di cui sopra, i ricercatori dagli Stati Uniti recentemente utilizzati il nuovo pH tingono la viola del paralume (LSV) in RT-LAMP. LSV ha migliore contrasto visivo fra massimi ed a basso pH e un più forte punto di flessione, di cui tutt'e due permettono all'interpretazione facile dei risultati e diminuiscono l'ambiguità. Il loro studio è stato pubblicato sul " server " della pubblicazione preliminare, medRxiv*.

Per la rilevazione di SARS-CoV-2, i ricercatori hanno usato la saliva come esemplare respiratorio invece dei tamponi rinofaringei. La campionatura della saliva è molto più facile confrontata a raccogliere i tamponi rinofaringei. Gli studi precedenti hanno confermato la compatibilità della saliva con RT-LAMP che prova anche in assenza della depurazione del RNA. Il gruppo ha aggiunto un punto di inattivazione che normalizza il pH, inattiva RNases e rilascia il RNA. Tuttavia, poiché la saliva è eterogenea in persone differenti, una strategia unitaglia di inattivazione non è possibile.

I nostri risultati dell'ottimizzazione di depurazione egualmente indicano parecchie direzioni inesplorate per ai i sistemi diagnostici basati a saliva futuri dell'acido nucleico.„

Così, hanno ottimizzato un protocollo di inattivazione con migliore successo attraverso i campioni eterogenei della saliva combinati con la viola del paralume. Hanno sviluppato un protocollo minuto di depurazione del RNA 10 dalla saliva e lo hanno nominato protocollo magnetico SalivaBeads della perla. Egualmente hanno sviluppato un bastone magnetico (MS), StickLAMP, che offre alla la depurazione basata a perla affidabile del RNA e l'accesso semplice ed a basso costo alle prove dagli esemplari della saliva.

“il ms egualmente presenta parecchi vantaggi sopra l'altro metodo tradizionale di separazione della perla, depurazione magnetica dello scaffale.„

Parecchie funzionalità di depurazione di SalivaBeads. (a) Un confronto di uniformità di colore del campione di preincubazione in 12 campioni, con le reazioni dell
Parecchie funzionalità di depurazione di SalivaBeads. (a) Un confronto di uniformità di colore del campione di preincubazione in 12 campioni, con le reazioni dell'actina e di SARS-CoV-2 parallelamente. L'input diretto della saliva inattivata ad una in una reazione basata Rosso del fenolo commerciale è confrontato ad un RNA SalivaBeads-depurativo introdotto nella nostra alla reazione basata a viola del paralume. (b) un confronto di RNA SARS-CoV-2 recuperato dalla saliva inventata campiona da qPCR N1, misurato dal numero delle copie recuperate da qPCR diviso dal numero delle copie inventate nella saliva. (c) un confronto visivo tra il limite dei detriti e le magnetico-perle quando isolano le perle dallo scaffale magnetico (sinistro) o da un bastone magnetico (destra). (d) un confronto della sensibilità fra SalivaBeads ha depurato tramite scaffale magnetico (ha andato) e bastone magnetico (giusto), da RT-LAMP con la viola del paralume.

Protocolli a basso costo ideali per le aree della basso risorsa che lottano per contenere diffusione di SARS-CoV-2

Secondo gli autori, i protocolli che di rilevazione SARS-CoV-2 si sono sviluppati sono redditizi, a di meno che $5/test senza scomporre nel lavoro e nel campione che si riuniscono e forniscono la migliore scalabilità confrontata ai protocolli attuali senza pregiudicare la sensibilità delle prove. Gli autori hanno aggiunto che i nuovi protocolli sono ideali per i banchi o i posti di lavoro con un piccolo numero di studenti o di impiegati nell'ordine di meno di 10 a migliaia basse. Il basso costo di nuovi protocolli li rende adatti abasso risorsa e gli ambienti underserved che sono stati influenzati sproporzionatamente dalla pandemia SARS-CoV-2.

I requisiti di strumentazione minimi ed il basso costo egualmente li rendono ben adattati per gli ambienti bassi delle risorse, che ancora potrebbero potere montare un laboratorio medio di complessità CLIA.„

Avviso *Important

il medRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
Susha Cheriyedath

Written by

Susha Cheriyedath

Susha has a Bachelor of Science (B.Sc.) degree in Chemistry and Master of Science (M.Sc) degree in Biochemistry from the University of Calicut, India. She always had a keen interest in medical and health science. As part of her masters degree, she specialized in Biochemistry, with an emphasis on Microbiology, Physiology, Biotechnology, and Nutrition. In her spare time, she loves to cook up a storm in the kitchen with her super-messy baking experiments.

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