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Sistema del nanobead del immunoengineer dei ricercatori per rilevazione di circolazione delle cellule del tumore

Un gruppo dei ricercatori immunoengineered un sistema del nanobead per l'isolamento e la rilevazione delle celle di circolazione del tumore (CTCs). Un rapporto sulla loro ricerca è stato rilasciato sul " server " della pubblicazione preliminare del bioRxiv*.

I tessuti cancerogeni hanno sparso le celle libere del tumore - conosciute come CTCs - nel sangue periferico. CTCs è associato con 90% delle morti in relazione con il Cancro. Quindi sono considerate biomarcatori prognostici nei sistemi diagnostici della metastasi e del cancro del tumore. Tuttavia, la mancanza di prova commerciale efficiente ha limitato questo approccio. Un gruppo interdisciplinare - dalla Harvard University negli Stati Uniti e la seconda università militare e l'università di Tongji in Cina - ha progettato ed ottenuto un metodo per individuare questo CTCs dal buffer o dal sangue periferico.

Costruendo l'isolamento magnetico ed alla la rilevazione basata a fluorescente per queste celle, il gruppo ha usato un sistema magnetico anticorpo-modificato e fluorescente anti--EpCAM dei nanobeads (iFMNS) - in un modo non distruttivo - con risparmio di temi nell'ordine di 70-95%.

Considerevolmente, questi piccoli nanobeads biocompatibili sono stati trovati per non avere impatto sull'attuabilità e sulla propagazione del CTCs. Ciò è principale importante per verificare le celle isolate facendo uso delle tecniche cellulari e molecolari dell'analisi. Poiché questa tecnica è non distruttiva, le celle isolate potrebbero direttamente essere usate per cultura, invertono la prova di reazione a catena della trascrizione-polimerasi (RT-PCR) e l'identificazione (ICC) immunocytochemistry.

(Molecola di adesione cellulare epiteliale, o CD326) un anticorpo anti--EpCAM monoclonale è coniugato con i nanobeads tramite ponti della streptavidin-biotina. Lega alle molecole di EpCAM presenti sulla superficie del CTCs. I nanoprobes magnetici fluorescenti anti--EpCAM ottenuti permettono alla visualizzazione diretta sulla superficie di CTCs catturato senza il contrassegno supplementare. La fluorescenza ultrabright (incapsulata con molti punti di quantum) migliora la sensibilità fluorescente di immunoassay rispetto al singolo immunoprobe dei punti di quantum.

Dalla caratterizzazione del ciclo di isteresi magnetica, i ricercatori indicano che questi nanobeads hanno i beni superparamagnetici eccellenti alla temperatura ambiente con un valore musicale di saturazione magnetica (41,6 emu/g e 6,04 emu/g) regolando la concentrazione di nanoparticelle magnetiche aggiunte.

In questo approccio, i ricercatori hanno preparato i nanobeads magnetici fluorescenti da una tecnica di olio in acqua di emulsione-evaporazione, facendo uso di poli (anidride stirolo-co-maleica) (PSMA) come il materiale di matrice per i nanobeads. Hanno precipitato il polimero con i punti intrappolati di quantum e le nanoparticelle magnetiche dentro i nanobeads del polimero - formare i nanobeads ibrido di nanoparticella/del polimero.

Questi nanobeads sono 114 nanometro di diametro (la dimensione idrodinamica media), con un indice analitico della multidispersione (PDI) di 0,13, indicante il buon monodispersity. I ricercatori reclamano la considerevole stabilità colloidale - nessun'aggregazione o precipitazione in tutto il trattamento.

In questo metodo, i ricercatori hanno incubato i nanobeads con le celle per 10 minuti. Hanno separato la sospensione delle cellule applicando un separatore di colonna magnetico ed hanno contato le celle catturate su un emocitometro sotto un microscopio di luce intensa.

“dovuto il trattamento delicato della reazione e l'isolamento di matrice del polimero fra QDs e MNPs, QDs si è incapsulato nei nanospheres del polimero ancora possiedono l'alta intensità fluorescente.„

I ricercatori avanzano hanno convalidato questa tecnica sui campioni di sangue periferici da un malato di cancro del polmone, con alta efficienza - con successo supportare l'applicazione clinica potenziale di questo metodo. Hanno osservato che il CTCs specificamente è stato riconosciuto nei campioni di sangue da WBCs, confermante che il sistema come-costruito potrebbe isolare ed identificare efficientemente CTCs per imitare i campioni clinici.

Egualmente indicano che la separazione magnetica facendo uso di iFMNS non induce il apoptosis delle cellule del tumore (morte programmata delle cellule). Il iFMNS ha catturato le celle del tumore proliferate senza un cambiamento significativo nel comportamento e nella morfologia rispetto ai campioni di controllo delle linee cellulari SGC-7901.

Attuabilità ed analisi di PCR delle celle catturate del tumore. (A) Immagine microscopica delle celle catturate tinte dal blu di trypan. (B) analisi di Apoptosis del controllo delle celle del tumore e delle celle catturate del tumore da citometria a flusso. Almeno 10.000 celle sono state misurate per campione. La proporzione (%) di numero delle cellule è indicata in ogni quadrante. La percentuale di celle possibili è stata indicata R4 nel quadrante (FITC-/PI-), le celle apoptotic in anticipo indicate R5 nel quadrante (FITC+/PI-), celle apoptotic/necrotiche recenti indicate R3 nel quadrante (FITC+/PI+). (C) le immagini microscopiche del controllo e le celle catturate del tumore sono state placcate e coltivato state per l
Attuabilità ed analisi di PCR delle celle catturate del tumore. (A) Immagine microscopica delle celle catturate tinte dal blu di trypan. (B) analisi di Apoptosis del controllo delle celle del tumore e delle celle catturate del tumore da citometria a flusso. Almeno 10.000 celle sono state misurate per campione. La proporzione (%) di numero delle cellule è indicata in ogni quadrante. La percentuale di celle possibili è stata indicata R4 nel quadrante (FITC-/PI-), le celle apoptotic in anticipo indicate R5 nel quadrante (FITC+/PI-), celle apoptotic/necrotiche recenti indicate R3 nel quadrante (FITC+/PI+). (C) le immagini microscopiche del controllo e le celle catturate del tumore sono state placcate e coltivato state per l'elettroforesi del gel di agarosio di 12, 24 e 48 H. dei prodotti dall'amplificazione di RT-PCR della mutazione di EGFR (D) e GAPDH (E). (Corsia 1: Scala del DNA, corsia 2: Le celle A549 hanno catturato con i iFMNs, la corsia 3: Celle HCC827 catturate con i iFMNs).

Cadmio-contenendo i punti di quantum sono limitati nel contrassegno biologico - pricipalmente dovuto la loro tossicità per la crescita delle cellule. In questo studio, l'impatto osservato sulla crescita delle cellule ed il apoptosis possono essere attribuiti all'incapsulamento spesso dello shell del polimero intorno ai punti di quantum che hanno impedito tutta la dispersione degli ioni del cadmio.

Inoltre, i ricercatori egualmente hanno studiato le celle catturate del tumore per l'analisi molecolare dell'acido nucleico, cercanti tutto il danno possibile. Trovano che questo approccio non ha influenza sull'estrazione del RNA e sulla reazione di PCR. Il RT-PCR può essere usato per analizzare le celle isolate senza dissociare il iFMNS.

Il iFMNS ultra-luminoso sviluppato è potenziale per isolamento rapido e semplice di CTCs e può essere adottato affinchè il contrassegno multiplexato migliori la prova e l'analisi di CTCs facendo uso di QDs con differenti colori e segnali della fluorescenza.„

Questo documento presenta un approccio semplice, biocompatibile e redditizio per la cattura, l'isolamento e la rilevazione simultanei di CTCs facendo uso di un sistema magnetico immunofluorescente del nanobead (iFMNS) ricoperto d'anticorpo anti--EpCAM monoclonale. Con risparmio di temi nell'ordine di 70-95% delle celle esaminate, l'attuabilità di 95% delle celle catturate ed il tempo complessivo rapido di risultati, questo metodo ha potuto essere vantaggioso sopra le tecniche correnti disponibili.

Riassumendo, il gruppo ha dimostrato un sistema magnetico fluorescente ultra-luminoso dei nanobeads che è stato costruito con successo per il bloccaggio simultaneamente efficiente e la rilevazione sensibile di CTCs nell'intero sangue combinando i punti di quantum, le nanoparticelle magnetiche e l'anticorpo anti--EpCAM.

La capacità di eseguire l'analisi biologica molecolare successiva, che era cruciale per l'ulteriori diagnosi e ricerca cliniche, è un punto culminante di questo approccio.

Avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
Dr. Ramya Dwivedi

Written by

Dr. Ramya Dwivedi

Ramya has a Ph.D. in Biotechnology from the National Chemical Laboratories (CSIR-NCL), in Pune. Her work consisted of functionalizing nanoparticles with different molecules of biological interest, studying the reaction system and establishing useful applications.

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