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Sistema do nanobead do immunoengineer dos pesquisadores para a detecção de circulação da pilha do tumor

Uma equipe dos pesquisadores immunoengineered um sistema do nanobead para o isolamento e a detecção de pilhas de circulação do tumor (CTCs). Um relatório em sua pesquisa foi liberado no server da pré-impressão do bioRxiv*.

Os tecidos cancerígenos derramaram as pilhas livres do tumor - conhecidas como CTCs - no sangue periférico. CTCs é associado com as 90% de mortes cancro-relacionadas. São considerados conseqüentemente biomarkers prognósticos em diagnósticos da metástase e do cancro do tumor. Contudo, a falta de um teste comercial eficiente limitou esta aproximação. Uma equipe interdisciplinar - da Universidade de Harvard nos E.U. e na segunda universidade militar e na universidade de Tongji em China - projectou e obteve um método detectar este CTCs do amortecedor ou do sangue periférico.

Projetando o isolamento magnético e a detecção fluorescente-baseada para estas pilhas, a equipe usou um anti-EpCAM sistema magnético anticorpo-alterado, fluorescente dos nanobeads (iFMNS) - em uma maneira não-destrutiva - com eficiência na escala de 70-95%.

Notàvel, estes nanobeads biocompatible pequenos foram encontrados para não ter nenhum impacto na viabilidade e na propagação do CTCs. Isto é principal importante para testar as pilhas isoladas usando técnicas celulares e moleculars da análise. Porque esta técnica é não-destrutiva, as pilhas isoladas poderiam directamente ser usadas para a cultura, invertem o teste da reacção em cadeia da transcrição-polimerase (RT-PCR), e a identificação (ICC) immunocytochemistry.

Um anti-EpCAM (molécula de adesão de pilha epitelial, ou CD326) anticorpo monoclonal é conjugado com os nanobeads através das pontes da streptavidin-biotina. Liga às moléculas de EpCAM actuais na superfície do CTCs. Os anti-EpCAM nanoprobes magnéticos fluorescentes obtidos permitem o visualização directo na superfície de CTCs capturado sem rotulagem adicional. A fluorescência ultrabright (encapsulada com muitos pontos do quantum) melhora a sensibilidade fluorescente do immunoassay comparada com o único immunoprobe dos pontos do quantum.

Da caracterização do laço de histerese magnética, os pesquisadores mostram que estes nanobeads têm uma propriedade superparamagnética excelente na temperatura ambiente com um valor ajustável da saturação magnética (41,6 emu/g e 6,04 emu/g) ajustando a concentração de nanoparticles magnéticos adicionados.

Nesta aproximação, os pesquisadores prepararam os nanobeads magnéticos fluorescentes por uma técnica da emulsão-evaporação da petróleo-em-água, usar-se poli (anídrido estireno-co-maleico) (PSMA) como o material de matriz para nanobeads. Precipitaram o polímero com os pontos prendidos em armadilha do quantum e os nanoparticles magnéticos dentro dos nanobeads do polímero - formar nanobeads do híbrido do polímero/nanoparticle.

Estes nanobeads são 114 nanômetro no diâmetro (o tamanho hidrodinâmico médio), com um deslocamento predeterminado da polidispersidade (PDI) de 0,13, indicando o bom monodispersity. Os pesquisadores reivindicam a estabilidade coloidal considerável - nenhuma agregação ou precipitação durante todo o processo.

Neste método, os pesquisadores incubaram os nanobeads com as pilhas por 10 minutos. Separaram a suspensão da pilha aplicando um separador de coluna magnético e contaram as pilhas capturadas em um hemocytometer sob um fotomicroscópio brilhante.

“Devido ao processo suave da reacção e ao isolamento de matriz do polímero entre QDs e MNPs, QDs encapsulou nos nanospheres do polímero ainda possuem a intensidade fluorescente alta.”

Os pesquisadores promovem validaram esta técnica em amostras de sangue periféricas de uma paciente que sofre de cancro do pulmão, com eficiência elevada - com sucesso apoiar a aplicação clínica potencial deste método. Observaram que o CTCs estêve reconhecido especificamente nas amostras de sangue de WBCs, confirmando que o sistema como-construído poderia eficientemente isolar e identificar CTCs para imitar amostras clínicas.

Igualmente mostram que a separação magnética que usa o iFMNS não induz o apoptosis da pilha do tumor (morte celular programada). O iFMNS capturou as pilhas do tumor proliferadas sem uma mudança significativa no comportamento e na morfologia comparados com as amostras de controle das linha celular SGC-7901.

Viabilidade e análises do PCR das pilhas capturadas do tumor. (a) Imagem microscópica das pilhas capturadas tingidas pelo azul trypan. (b) Análise do Apoptosis do controle de pilhas do tumor e de pilhas capturadas do tumor pelo cytometry de fluxo. Pelo menos 10.000 pilhas foram medidas pela amostra. A proporção (%) de número da pilha é mostrada em cada quadrante. A proporção de pilhas viáveis foi mostrada no quadrante R4 (FITC-/PI-), pilhas apoptotic adiantadas mostradas no quadrante R5 (FITC+/PI-), pilhas apoptotic/necrotic atrasadas mostradas no quadrante R3 (FITC+/PI+). (c) As imagens microscópicas do controle e as pilhas capturadas do tumor foram chapeadas e cultivadas para a electroforese do gel do Agarose de 12, 24, e 48 H. dos produtos da amplificação de RT-PCR da mutação de EGFR (d) e do GAPDH (e). (Pista 1: Escada do ADN, pista 2: As pilhas A549 capturaram com iFMNs, pista 3: Pilhas HCC827 capturadas com iFMNs).
Viabilidade e análises do PCR das pilhas capturadas do tumor. (a) Imagem microscópica das pilhas capturadas tingidas pelo azul trypan. (b) Análise do Apoptosis do controle de pilhas do tumor e de pilhas capturadas do tumor pelo cytometry de fluxo. Pelo menos 10.000 pilhas foram medidas pela amostra. A proporção (%) de número da pilha é mostrada em cada quadrante. A proporção de pilhas viáveis foi mostrada no quadrante R4 (FITC-/PI-), pilhas apoptotic adiantadas mostradas no quadrante R5 (FITC+/PI-), pilhas apoptotic/necrotic atrasadas mostradas no quadrante R3 (FITC+/PI+). (c) As imagens microscópicas do controle e as pilhas capturadas do tumor foram chapeadas e cultivadas para a electroforese do gel do Agarose de 12, 24, e 48 H. dos produtos da amplificação de RT-PCR da mutação de EGFR (d) e do GAPDH (e). (Pista 1: Escada do ADN, pista 2: As pilhas A549 capturaram com iFMNs, pista 3: Pilhas HCC827 capturadas com iFMNs).

Cádmio-contendo pontos do quantum são limitados na rotulagem biológica - principalmente devido a sua toxicidade para o crescimento da pilha. Neste estudo, o impacto observado no crescimento da pilha e o apoptosis podem ser atribuídos à capsulagem grossa do escudo do polímero em torno dos pontos do quantum que impediram todo o escapamento dos íons do cádmio.

Além disso, os pesquisadores igualmente investigaram as pilhas capturadas do tumor para a análise molecular do ácido nucleico, procurando todo o dano possível. Encontram que esta aproximação não tem nenhuma influência na extracção do RNA e na reacção do PCR. O RT-PCR pode ser usado para analisar as pilhas isoladas sem separar o iFMNS.

O iFMNS ultra-brilhante desenvolvido é potencial para o isolamento rápido e simples de CTCs e pode ser adotado para que a rotulagem multiplexada melhore o teste e a análise de CTCs usando QDs com cores e sinais diferentes da fluorescência.”

Este papel apresenta uma aproximação simples, biocompatible e eficaz na redução de custos para a captura, o isolamento, e a detecção simultâneos de CTCs usando um sistema magnético immuno-fluorescente do nanobead (iFMNS) revestido com um anti-EpCAM anticorpo monoclonal. Com eficiência na escala de 70-95% das pilhas testadas, a viabilidade de 95% das pilhas capturadas, e o tempo de resposta rápido dos resultados, este método podia ser vantajoso sobre as técnicas actuais disponíveis.

Em resumo, a equipe demonstrou um sistema magnético fluorescente ultra-brilhante dos nanobeads que fosse construído com sucesso para a captação simultaneamente eficiente e a detecção sensível de CTCs no sangue inteiro combinando pontos do quantum, nanoparticles magnéticos, e o anti-EpCAM anticorpo.

A capacidade para executar a análise biológica molecular subseqüente, que era crucial para um diagnóstico e uma pesquisa clínicos mais adicionais, é um destaque desta aproximação.

Observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
Dr. Ramya Dwivedi

Written by

Dr. Ramya Dwivedi

Ramya has a Ph.D. in Biotechnology from the National Chemical Laboratories (CSIR-NCL), in Pune. Her work consisted of functionalizing nanoparticles with different molecules of biological interest, studying the reaction system and establishing useful applications.

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