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Sistema del nanobead del immunoengineer de los investigadores para la detección de circulación de la célula del tumor

Las personas de investigadores immunoengineered un sistema del nanobead para el aislamiento y la detección de las células de circulación del tumor (CTCs). Un parte sobre su investigación se ha liberado en el servidor de la prueba preliminar del bioRxiv*.

Los tejidos cacerígenos vertieron las células libres del tumor - conocidas como CTCs - en la sangre periférica. CTCs se asocia al 90% de muertes cáncer-relacionadas. Por lo tanto se consideran los biomarkers pronósticos en diagnósticos de la metástasis y del cáncer del tumor. Sin embargo, la falta de una prueba comercial eficiente ha limitado esta aproximación. Las personas interdisciplinarias - de la Universidad de Harvard en los E.E.U.U. y la segunda universidad militar y la universidad de Tongji en China - han diseñado y han obtenido un método para descubrir este CTCs del almacenador intermedio o de la sangre periférica.

Dirigiendo el aislamiento magnético y la detección fluorescente-basada para estas células, las personas utilizaron un sistema magnético anticuerpo-modificado, fluorescente anti-EpCAM de los nanobeads (iFMNS) - de una manera no destructiva - con eficiencia en el rango de 70-95%.

Notablemente, estos pequeños nanobeads biocompatibles fueron encontrados para no tener ningún impacto en la viabilidad y la propagación del CTCs. Esto es mayor importante para probar las células aisladas usando técnicas celulares y moleculares del análisis. Porque esta técnica es no destructiva, las células aisladas se podrían utilizar directamente para la cultura, invierten la prueba de la reacción en cadena de la transcripción-polimerasa (RT-PCR), y la identificación (ICC) immunocytochemistry.

(Molécula de adherencia de célula epitelial, o CD326) un anticuerpo anti-EpCAM monoclonal se conjuga con los nanobeads vía los puentes de la streptavidin-biotina. Ata a las moléculas de EpCAM presentes en la superficie del CTCs. Los nanoprobes magnéticos fluorescentes antis-EpCAM obtenidos habilitan la visualización directa en la superficie de CTCs capturado sin la etiqueta adicional. La fluorescencia ultrabright (encapsulada con muchos puntos del quantum) perfecciona la sensibilidad fluorescente del immunoensayo comparada con el único immunoprobe de los puntos del quantum.

De la caracterización del rizo de histéresis magnética, los investigadores muestran que estos nanobeads tienen una propiedad superparamagnética excelente en la temperatura ambiente con un valor armonioso de la saturación magnética (41,6 emu/g y 6,04 emu/g) ajustando la concentración de nanoparticles magnéticos adicionales.

En esta aproximación, los investigadores prepararon los nanobeads magnéticos fluorescentes por una técnica de aceite en agua de la emulsión-evaporación, usando polivinílico (el anhídrido estireno-co-maleico) (PSMA) como el material de matriz para los nanobeads. Precipitaron el polímero con los puntos tendidos una trampa del quantum y los nanoparticles magnéticos dentro de los nanobeads del polímero - formación de nanobeads del híbrido del polímero/del nanoparticle.

Estos nanobeads son 114 nanómetro en el diámetro (la talla hidrodinámica media), con un índice de la polidispersidad (PDI) de 0,13, indicando buen monodispersity. Los investigadores demandan considerable estabilidad coloidal - ninguna agregación o precipitación en el proceso.

En este método, los investigadores incubaron los nanobeads con las células por 10 minutos. Separaron la suspensión de la célula aplicando un separador de olumna magnético y contaron las células capturadas en un hemocitómetro bajo un microscopio liviano brillante.

“Debido al proceso suave de la reacción y al aislamiento de matriz del polímero entre QDs y MNPs, QDs encapsuló en los nanospheres del polímero todavía poseen alta intensidad fluorescente.”

Los investigadores fomentan validaron esta técnica en muestras de sangre periféricas de un enfermo de cáncer del pulmón, con la eficacia alta - con éxito soportar el uso clínico potencial de este método. Observaron que el CTCs fue reconocido específicamente en las muestras de sangre de WBCs, confirmando que el sistema como-construido podría aislar y determinar eficientemente CTCs para imitar muestras clínicas.

También muestran que la separación magnética usando iFMNS no induce el apoptosis de la célula del tumor (muerte celular programada). El iFMNS capturó las células del tumor proliferadas sin un cambio importante en el comportamiento y la morfología comparados con las muestras de mando de las variedades de células SGC-7901.

Viabilidad y análisis de la polimerización en cadena de las células capturadas del tumor. (a) Imagen microscópica de las células capturadas teñidas por el azul trypan. (b) Análisis del Apoptosis del mando de las células del tumor y de las células capturadas del tumor por cytometry de flujo. Por lo menos 10.000 células fueron medidas por muestra. La proporción (%) de número de la célula se muestra en cada cuadrante. La proporción de células viables fue mostrada en el cuadrante R4 (FITC-/PI-), células apoptotic tempranas mostradas en el cuadrante R5 (FITC+/PI-), últimas células apoptotic/necróticas mostradas en el cuadrante R3 (FITC+/PI+). (c) Las imágenes microscópicas del mando y las células capturadas del tumor fueron chapadas y cultivadas para la electroforesis del gel de la agarosa de 12, 24, y 48 H. de productos de la amplificación de RT-PCR de la mutación de EGFR (d) y de GAPDH (e). (Senda 1: Escalera de la DNA, senda 2: Las células A549 capturaron con los iFMNs, senda 3: Células HCC827 capturadas con los iFMNs).
Viabilidad y análisis de la polimerización en cadena de las células capturadas del tumor. (a) Imagen microscópica de las células capturadas teñidas por el azul trypan. (b) Análisis del Apoptosis del mando de las células del tumor y de las células capturadas del tumor por cytometry de flujo. Por lo menos 10.000 células fueron medidas por muestra. La proporción (%) de número de la célula se muestra en cada cuadrante. La proporción de células viables fue mostrada en el cuadrante R4 (FITC-/PI-), células apoptotic tempranas mostradas en el cuadrante R5 (FITC+/PI-), últimas células apoptotic/necróticas mostradas en el cuadrante R3 (FITC+/PI+). (c) Las imágenes microscópicas del mando y las células capturadas del tumor fueron chapadas y cultivadas para la electroforesis del gel de la agarosa de 12, 24, y 48 H. de productos de la amplificación de RT-PCR de la mutación de EGFR (d) y de GAPDH (e). (Senda 1: Escalera de la DNA, senda 2: Las células A549 capturaron con los iFMNs, senda 3: Células HCC827 capturadas con los iFMNs).

Cadmio-conteniendo puntos del quantum se limitan en la etiqueta biológica - principal debido a su toxicidad para el incremento de la célula. En este estudio, el impacto observado en incremento de la célula y el apoptosis se pueden atribuir a la encapsulación gruesa de la granada del polímero alrededor de los puntos del quantum que previnieron cualquier fuga de los iones del cadmio.

Por otra parte, los investigadores también investigaron las células capturadas del tumor para el análisis molecular del ácido nucléico, buscando cualquier daño posible. Encuentran que esta aproximación no tiene ninguna influencia en la extracción del ARN y la reacción de la polimerización en cadena. El RT-PCR se puede utilizar para analizar las células aisladas sin la disociación del iFMNS.

El iFMNS ultra-brillante desarrollado es potencial para el aislamiento rápido y simple de CTCs y se puede adoptar para que la etiqueta multiplexada perfeccione la prueba y el análisis de CTCs usando QDs con diversos colores y señales de la fluorescencia.”

Este papel presenta una aproximación simple, biocompatible y de poco costo para la captura, el aislamiento, y la detección simultáneos de CTCs usando un sistema magnético inmunofluorescente del nanobead (iFMNS) recubierto con un anticuerpo anti-EpCAM monoclonal. Con eficiencia en el rango de 70-95% de las células probadas, la viabilidad del 95% de las células capturadas, y el tiempo de vuelta rápido de los resultados, este método podía ser ventajoso sobre las técnicas actuales disponibles.

En resumen, las personas han demostrado un sistema magnético fluorescente ultra-brillante de los nanobeads que fue construido con éxito para la captura simultáneamente eficiente y la detección sensible de CTCs en sangre entera combinando puntos del quantum, nanoparticles magnéticos, y el anticuerpo anti-EpCAM.

La capacidad de realizar el análisis biológico molecular subsiguiente, que era crucial para la diagnosis y la investigación clínicas adicionales, es un punto culminante de esta aproximación.

Advertencia *Important

el bioRxiv publica los partes científicos preliminares que par-no se revisan y, por lo tanto, no se deben mirar como concluyentes, conduce práctica clínica/comportamiento relativo a la salud, o tratado como información establecida.

Journal reference:
Dr. Ramya Dwivedi

Written by

Dr. Ramya Dwivedi

Ramya has a Ph.D. in Biotechnology from the National Chemical Laboratories (CSIR-NCL), in Pune. Her work consisted of functionalizing nanoparticles with different molecules of biological interest, studying the reaction system and establishing useful applications.

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