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Lo studio offre i nuovi protocolli per l'ordinamento genomica di alta qualità SARS-CoV-2

In tardi dicembre 2019, la malattia 2019 (COVID-19) di coronavirus in primo luogo è stata diagnosticata nella città di Wuhan, Cina, causante una malattia respiratoria facilmente ereditaria. Da ora a marzo 2020, l'organizzazione mondiale della sanità (WHO) ha dichiarato il suo scoppio una pandemia globale.

Causato dal coronavirus 2 (SARS-CoV-2) di sindrome respiratorio acuto severo, COVID-19 ha infettato oltre 107,48 milione di persone globalmente. Fin qui, più di 2,35 milioni già sono morto.

Mentre la pandemia si è evoluta, il virus ha subito una mutazione nelle varianti che sono più facilmente ereditarie e possono potenzialmente causare i sintomi più severi.

Flusso di lavoro per sequenziamento del genoma virale SARS-CoV-2 con uno strumento del servo.
Flusso di lavoro per sequenziamento del genoma virale SARS-CoV-2 con uno strumento del servo.

Ora, i ricercatori alla Southern Illinois University, S.U.A., hanno presentato un insieme completo e ben-convalidato dei protocolli di lavoro per l'ordinamento dei genoma di alta qualità SARS-CoV-2 nell'alta capacità di lavorazione dai campioni pazienti. Ciò può aiutare nella conduzione del sequenziamento del genoma virale, che può contribuire a determinare le mutazioni del virus ed aiutare i governi pianificazione nell'applicare le misure per staccare la pandemia dal gambo.

Sequenziamento del genoma virale

È cruciale eseguire il sequenziamento del genoma virale per contribuire ad affrontare tutti i problemi potenziali che possono sorgere con le nuove mutazioni del virus. I virus possono evolversi rapidamente, che possono provocare il transmissibility o la virulenza intensificato e posare una grave minaccia alla gente universalmente.

Il SARS-CoV-2 ha due nuove varianti che sono più ereditarie e possono potenzialmente causare i sintomi più severi. La variante BRITANNICA già si è sparsa ad altri paesi, causanti i casi d'ascesa nei posti come gli Stati Uniti, mentre la variante sudafricana può eludere il prodotto anticorpi dovuto la vaccinazione.

Quindi, il sequenziamento del genoma virale può delineare le regioni conservate e mutabili che potrebbero fornire le comprensioni apprezzate nello sviluppo di efficaci vaccini e dei trattamenti per SARS-CoV-2.

Corrente, ci sono molti vari approcci ad ordinare i genoma SARS-CoV-2, come l'ordinamento metagenomic, i metodi basati PCR-amplificazione ed ordinamento mirato a di arricchimento. Due di questi metodi, specialmente il metagenomic e mirano ai genoma, sono costosi generare i genoma completi su grande scala.

Nel frattempo, ad un'amplificazione basata a PCR può essere una soluzione potenziale per indirizzare le limitazioni degli altri metodi. Al il metodo basato a PCR di amplificazione amplia l'obiettivo di interesse allo stesso tempo.

Lo studio

Nello studio corrente, pubblicato sul " server " della pubblicazione preliminare del bioRxiv*, i ricercatori hanno introdotto un metodo per ordinare i genoma di alta qualità SARS-CoV-2 in un livello interamente dai campioni pazienti. Il laboratorio del gruppo di ricerca ha adottato e modificato i protocolli, che sono stati sviluppati tramite la rete ARTICA ai genoma virali di sequenze SARS-CoV-2 che utilizzano il nanopore di MiniION che ordina la piattaforma dalle tecnologie di Oxford Nanopore (ONT).

Da là, il gruppo ha presentato un'intera sequenza convalidata, compreso una guida di howto per ogni punto dall'estrazione virale dell'acido ribonucleico (RNA) a visualizzazione di dati. Il gruppo ha convalidato i nuovi protocolli through il riuscito trattamento di più di 1.000 campioni ed ordinando più di 600 genoma di alta qualità SARS-CoV-2 dall'Illinois.

Per arrivare ai risultati di studio, i ricercatori hanno eseguito l'intero flusso di lavoro per produrre i genoma SARS-CoV-2 in un formato della lastra grossa di 96 pozzi. Comincia con l'estrazione del RNA dai media virali del trasporto (VTM) che contiene i tamponi rinofaringei (NP) paziente-derivati. Poi, il gruppo converte il RNA estratto in DNA complementare (cDNA), che è utilizzato per l'approssimazione del caricamento virale dalla PCR quantitativa (qPCR).

Dopo la conduzione del qPCR, i ricercatori hanno ampliato il cDNA virale del genoma in un formato di 96 pozzi per diminuire contaminare le sequenze e per amplificare il numero di copia dei genoma virali. In questo metodo, i ricercatori hanno usato due raggruppamenti delle mani di fondo progettate tramite la rete ARTICA.

Dopo, il gruppo eseguito una PCR della multisala con due raggruppamenti delle mani di fondo ARTICHE ed i due raggruppamenti separati del prodotto di PCR per ogni campione sono riuniti, mentre i amplicons sono isolati via un punto di pulizia.

Infine, i genoma con copertura adeguata possono essere veduti ed osservati dalle analisi filogenetiche e dalla variante che chiama fatte mediante per mezzo degli strumenti del web come Nextstrain.

Visualizzazione di Nextstrain e visualizzazione filogenetiche della mappa delle sequenze del genoma SARS-CoV-2. (A) Albero filogenetico generato dalla conduttura di Nextstrain. Le sequenze sono derivate dall
Visualizzazione di Nextstrain e visualizzazione filogenetiche della mappa delle sequenze del genoma SARS-CoV-2. (A) Albero filogenetico generato dalla conduttura di Nextstrain. Le sequenze sono derivate dall'Illinois contenuto campioni, fra aprile 2020 e gennaio 2021 e sono ordinate dal nostro laboratorio. Ogni colore rappresenta un clade differente di Nextstrain. (B) mappa di Illinois che mostra le posizioni del campione, dalla contea. La dimensione del cerchio indica il numero relativo delle sequenze derivate da quella contea. Il diagramma a torta indica la distribuzione proporzionale dei clades di Nextstrain a quella posizione. I colori di designazione di Clade per il comitato A e B sono: 19A (blu scuro), 19B (blu), 20A (blu-chiaro), 20B (verde), 20C (giallo verde), 20D (giallo), 20E (giallo arancione), 20G (arancio).

Quindi, il protocollo può fornire un modo più facile realizzare l'ordinamento. I protocolli applicano la PCR ARTICA e il nanopore del servo alla sequenza 96 campiona per volta.

Il gruppo crede che il nuovo protocollo possa fornire un punto di partenza affidabile per coloro che vuole produrre le sequenze del genoma SARS-CoV-2 facendo uso di nanopore che ordina la tecnologia.

Avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

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Journal reference:
Angela Betsaida B. Laguipo

Written by

Angela Betsaida B. Laguipo

Angela is a nurse by profession and a writer by heart. She graduated with honors (Cum Laude) for her Bachelor of Nursing degree at the University of Baguio, Philippines. She is currently completing her Master's Degree where she specialized in Maternal and Child Nursing and worked as a clinical instructor and educator in the School of Nursing at the University of Baguio.

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