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Una strategia differente per rilevazione dell'acqua di scarico di SARS-CoV-2

I ricercatori hanno verificato vari concentrazione nel RNA e metodi ed analisi dell'estrazione per sviluppare un protocollo per le prove del SARS-CoV-2 in acqua di scarico, che può contribuire a migliorare la sorveglianza COVID-19.

COVID-19, causato dal coronavirus 2 (SARS-CoV-2) di sindrome respiratorio acuto severo, è riflesso solitamente diagnosticando i pazienti sintomatici e rintracciando i loro contatti. Tuttavia, questo non può essere molto accurato mentre richiede la partecipazione determinata volontaria e non include i casi asintomatici, facendola che sfida per gestire la diffusione.

L'acqua di scarico di prova è un altro metodo di video la diffusione e della circolazione delle malattie infettive. Gli indicatori di malattia quali i genoma virali sono rilasciati e trasportati nell'acqua di scarico. L'abbondanza di agenti patogeni nell'acqua di scarico può essere usata per arguire la diffusione della malattia.

Parecchi studi hanno riferito usando l'acqua di scarico per riflettere la trasmissione di SARS-CoV-2. Tuttavia, ci sono alcune sfide a fare questo. Poiché l'acqua di scarico ha molto altri materia organica e metalli, la rilevazione di bassi livelli del virus può essere difficile. Inoltre, non è conosciuto precisamente in che modulo il virus SARS-CoV-2 è presente in feci, quali le particelle del virus, frammenti, ecc, che possono essere suddivisi più ulteriormente durante il trasporto di acqua di scarico. Così, è essenziale per avere i metodi attendibili di concentrazione e rilevazione analitica dei virus.

Strategie di prova

In una pubblicazione ha pubblicato sul " server " della pubblicazione preliminare del medRxiv*, ricercatori dal rapporto del Belgio un confronto dei metodi bioanalytical differenti per la concentrazione di RNA SARS-CoV-2 in acqua di scarico.

Generalità schematica di sorveglianza delle acque luride per la determinazione della circolazione SARS-CoV-2 nella popolazione in genere.
Generalità schematica di sorveglianza delle acque luride per la determinazione della circolazione SARS-CoV-2 nella popolazione in genere.

Il gruppo ha ottenuto i campioni dell'acqua di scarico da otto impianti di trattamento delle acque reflue differenti nel Belgio e l'acqua di scarico sanitaria da una società che ha avuta un numero alto dei casi COVID-19. Hanno usato i metodi differenti di ultrafiltrazione facendo uso della precipitazione di parecchie unità di centrifugazione e del polietilene glicole (PARITÀ) per concentrare il RNA virale. Il metodo che ha dato i più bassi e livelli più riproducibili di soglia del ciclo (Ct) per l'amplificazione del gene SARS-CoV-2 è stato usato per concentrazione del campione.

Il gruppo egualmente ha provato parecchi kit commerciali dell'estrazione del RNA per scegliere quello che ha dato i valori di Ct più bassi e più riproducibili. Hanno usato sia RT-PCR che la PCR digitale (dPCR) per l'amplificazione di RNA virale. il dPCR può essere più utile per provare l'acqua di scarico poichè è meno sensibile agli inibitori di PCR presenti in acqua di scarico e fornisce la quantificazione assoluta.

Protocolli analitici migliori

Sulla base dei risultati di concentrazione per i campioni raccolti nell'agosto 2020, quando il numero dei casi era più basso confrontato a quelli nella seconda onda, il gruppo ha trovato che precipitazione della PARITÀ non potrebbe individuare N1 e geni del N2 e concentrazioni di coronavirus porcino era considerevolmente più basso. Quindi, questo metodo non è stato perseguito più ulteriormente.

Verificando l'effetto delle dimensioni del poro del filtro e dei volumi di campione differenti, il gruppo ha trovato che sebbene le più piccole dimensioni del poro potessero concentrare meglio i campioni, piombo spesso per filtrare il bloccaggio e la concentrazione di inibitori di PCR. Così, hanno usato un taglio del peso molecolare di 50 - 100 volumi di campione e di kDa di 50 - 500 ml. I livelli virali erano troppo bassi per individuare senza concentrazione. Quindi un punto di concentrazione era necessario individuare SARS-CoV-2 in acqua di scarico. Nel protocollo definitivo, i ricercatori hanno usato l'ultracentrifugazione con i filtri da Centricon.

Sebbene sia il metodo manuale di estrazione del RNA che il metodo automatizzato facendo uso di Maxwell PureFood ed il kit OMG dell'autenticazione siano comparabili per l'estrazione del RNA, il gruppo ha scelto il metodo automatizzato per la sua alta capacità di lavorazione.

Gli autori hanno trovato sia RT-PCR che il dPCR hanno dato gli stessi livelli di concentrazione, indicanti che la sensibilità di entrambe le analisi è simile. Tuttavia, il vantaggio di dPCR è che non ha bisogno di una curva standard.

Quando l'acqua è trasportata nel sistema di fognatura, il genoma SARS-CoV-2 può essere rotto nei più piccoli frammenti del RNA. Il gruppo ha trovato i geni di E e del N2 individuati per essere sopra il limite più basso di quantificazione per più di 87,5% dei campioni dell'acqua di scarico. Tuttavia, stava aumentando la variabilità nel gene di E con tempo. Poiché c'era la variabilità significativa nella concentrazione indigena al livello più basso di quantificazione, valutare la stabilità è provocatoria.

Il congelamento campiona le copie in diminuzione del gene 10 volte, mentre i livelli elevati di rilevazione erano in campioni tenuti a 4 °C. Gli autori suggeriscono di tenere i campioni a questa temperatura e di analizzarli entro tre giorni della raccolta.

Malgrado i protocolli migliori di sviluppo, c'è la variabilità ancora significativa nei metodi di concentrazione del campione poichè non c'è standard di esterno da paragonare a. Inoltre, lo stato del genoma SARS-CoV-2 in acqua di scarico è molto incerto a causa di degradazione potenziale nel sistema di fognatura. Ulteriore ricerca è necessaria capire meglio queste variabilità e l'uso potenziale all'dell'epidemiologia basata a acqua di scarico per sorveglianza SARS-CoV-2.

Avviso *Important

il medRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
Lakshmi Supriya

Written by

Lakshmi Supriya

Lakshmi Supriya got her BSc in Industrial Chemistry from IIT Kharagpur (India) and a Ph.D. in Polymer Science and Engineering from Virginia Tech (USA).

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