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Uma estratégia diferente para a detecção das águas residuais de SARS-CoV-2

Os pesquisadores testaram uma variedade de concentração do RNA e métodos e ensaios da extracção para desenvolver um protocolo para testar SARS-CoV-2 nas águas residuais, que podem ajudar a melhorar a fiscalização COVID-19.

COVID-19, causado pelo coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2), é monitorado geralmente diagnosticando pacientes sintomáticos e seguindo seus contactos. Contudo, isto não pode ser muito exacto como exige a participação individual voluntária e não inclui casos assintomáticos, fazendo a que desafia para controlar a propagação.

As águas residuais do teste são um outro método de monitorar a propagação e a circulação de doenças infecciosas. Os marcadores da doença tais como genomas virais são liberados e transportados nas águas residuais. A abundância de micróbios patogénicos nas águas residuais pode ser usada para pressupr a propagação da doença.

Diversos estudos relataram usando águas residuais para monitorar a transmissão de SARS-CoV-2. Contudo, há alguns desafios a fazer isto. Porque as águas residuais têm muito outros matéria orgânica e metais, a detecção de baixos níveis do vírus pode ser difícil. Além, não se sabe precisamente em que formulário o vírus SARS-CoV-2 esta presente na fezes, tal como partículas do vírus, os fragmentos, e assim por diante, que podem ser divididos mais durante o transporte das águas residuais. Assim, é essencial ter métodos seguros da concentração e a detecção analítica de vírus.

Estratégias do teste

Em um artigo de investigação publicou no server da pré-impressão do medRxiv*, pesquisadores do relatório de Bélgica uma comparação de métodos bioanalytical diferentes para a concentração do RNA SARS-CoV-2 nas águas residuais.

Vista geral esquemática da fiscalização da água de esgoto para determinar a circulação SARS-CoV-2 na população geral.
Vista geral esquemática da fiscalização da água de esgoto para determinar a circulação SARS-CoV-2 na população geral.

A equipe obteve amostras das águas residuais de oito plantas de tratamento de águas residuais diferentes em Bélgica e águas residuais sanitárias de uma empresa que tivesse um número alto dos casos COVID-19. Usaram métodos diferentes do ultrafiltration usando a precipitação de diversos dispositivos da centrifugação e de glicol de polietileno (PEG) para concentrar o RNA viral. O método que deu os mais baixos e níveis os mais reprodutíveis de ponto inicial do ciclo (Ct) para a amplificação do gene SARS-CoV-2 foi usado para a concentração da amostra.

A equipe igualmente testou diversos jogos comerciais da extracção do RNA para escolher esse que deu os mais baixos e valores os mais reprodutíveis do Ct. Usaram RT-PCR e PCR digital (dPCR) para a amplificação do RNA viral. o dPCR pode ser mais útil para testar águas residuais porque é menos sensível aos inibidores do PCR actuais nas águas residuais e fornece a quantificação absoluta.

Protocolos analíticos melhorados

Baseado nos resultados da concentração para as amostras recolhidas em agosto de 2020, quando o número de casos era mais baixo comparado àqueles na segunda onda, a equipe encontrou que precipitação do PEG não poderia detectar N1 e genes do N2 e concentrações de coronavirus suíno era consideravelmente mais baixo. Daqui, este método não foi levado a cabo mais.

Em cima de testar o efeito de tamanhos do poro do filtro e de volumes de amostra diferentes, a equipe encontrou que embora os tamanhos menores do poro pudessem concentrar amostras melhor, conduziram frequentemente para filtrar o bloqueio e a concentração de inibidores do PCR. Assim, usaram uma interrupção do peso molecular de 50 a 100 volumes do kDa e de amostra de 50 a 500 mL. Os níveis virais eram demasiado baixos detectar sem concentração. Daqui uma etapa da concentração era necessário detectar SARS-CoV-2 nas águas residuais. No protocolo final, os pesquisadores usaram o ultracentrifugation com filtros de Centricon.

Embora o método manual da extracção do RNA e o método automatizado usando Maxwell PureFood e o jogo da autenticação do GMO fossem comparáveis para a extracção do RNA, a equipe escolheu o método automatizado para sua produção alta.

Os autores encontraram RT-PCR e o dPCR deram os mesmos níveis de concentração, indicando que a sensibilidade de ambos os ensaios é similar. Contudo, a vantagem do dPCR é que não precisa uma curva padrão.

Quando a água é transportada no sistema de esgoto, o genoma SARS-CoV-2 pode quebrar-se em fragmentos menores do RNA. A equipe encontrou os genes do N2 e do E detectados para estar acima do limite mais baixo de quantificação para mais de 87,5% das amostras das águas residuais. Contudo, aumentava a variabilidade no gene de E com tempo. Desde que havia uma variabilidade significativa na concentração nativa no nível inferior da quantificação, avaliar a estabilidade é desafiante.

Congelar-se prova cópias diminuídas do gene 10 vezes, visto que os níveis da detecção eram mais altos nas amostras mantidas em 4 °C. Os autores sugerem manter amostras nesta temperatura e analisá-las no prazo de três dias da coleção.

Apesar dos melhores protocolos tornando-se, há uma variabilidade ainda significativa em métodos de concentração da amostra porque há um padrão não externo a comparar com. Também, o estado do genoma SARS-CoV-2 nas águas residuais é muito incerto devido à degradação potencial no sistema de esgoto. Uma pesquisa mais adicional é necessário compreender melhor estas variabilidades e o uso potencial da epidemiologia águas residuais-baseada para a fiscalização SARS-CoV-2.

Observação *Important

o medRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
Lakshmi Supriya

Written by

Lakshmi Supriya

Lakshmi Supriya got her BSc in Industrial Chemistry from IIT Kharagpur (India) and a Ph.D. in Polymer Science and Engineering from Virginia Tech (USA).

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