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La recherche explique des mutations de la variante SARS-CoV-2 surmontées par nanobodies polyvalents

Depuis le début (la maladie 2019 de coronavirus) de la pandémie COVID-19 fin décembre 2019, le coronavirus étiologique 2 (SARS-CoV-2) de syndrôme respiratoire aigu sévère d'agent de cette maladie a entraîné plus de 2,6 millions de morts mondiales de plus de 117 millions d'infections rapportées. Cependant, pendant que des vaccins neufs sont administrés contre la tension héréditaire, beaucoup de variantes mutées du virus apparaissent en travers du monde.

Pour développer des stratégies complémentaires instamment requises pour éviter n'importe quelle évasion virale, les chercheurs emploient des approches alternatives. Nanobodies attirent l'attention récent en tant que solutions de rechange thérapeutiques efficaces.

Dans un papier récent de prétirage de bioRxiv*, les chercheurs ont isolé d'anti-RBD nanobodies des lamas et de « nanomice » (ils ont conçu pour produire VHHs copié à partir des alpaga, des dromadaires et des chameaux). Dans l'étude, ils ont recensé deux ensembles de nanobodies hautement de neutralisation - un qui ont identifié une région en dehors du site d'ACE2-binding, et l'autre s'est exclusivement concentré sur le RBD (domaine obligatoire de récepteur) - ACE2 (surface adjacente d'enzyme de conversion de l'angiotensine 2), manqu pour neutraliser des pseudoviruses transportant l'E484 ou des remplacements de N501Y.

L'enveloppe SARS-CoV-2 coronated avec la pointe de glycoprotéine, activant l'entrée du virus dans les cellules humaines d'hôte. La protéine de S grippe à l'ACE2 sur les cellules hôte par l'intermédiaire du RBD.

L'affinité élevée de RBD à gripper à l'ACE2 est à la base du transmissibility plus élevé de SARS-CoV-2. Par conséquent, cette région est l'objectif de concevoir les anticorps efficaces et les vaccins.

Nanobodies sont les protéines minuscules et antigène-grippantes. Ce sont les domaines variables (éclats de VHH) des anticorps réseau réseau lourds (HCAbs) d'isolement dans des camelids. Comparé aux anticorps de souris et d'être humain (~150 kDa dans la taille), les nanobodies sont les domaines variables des anticorps réseau réseau lourds de camelids maintenant la pleine spécificité d'antigène à un poids moléculaire de ~15 kDa.

Production et caractérisation de nanomice. (a) 30 VHHs ont été choisis parmi l
Production et caractérisation de nanomice. (a) 30 VHHs ont été choisis parmi l'alpaga, le dromadaire et le chameau pour produire un magasin, qui a été inséré par l'intermédiaire de CRISPR-Cas9 au lieu de le lieu de la souris VH (2.5MB dans la taille). L'exon CH1 de Cμ et de Cg1 a été également effacé pour éviter misfolding du réseau lourd d'anticorps si impossible d'appareiller avec les réseaux légers. (b) Analyse de cytométrie de flux des cellules de B spléniques de B220+ du GRAMMAGE ou du nanomice hétérozygote. IgM+Igk+ représentent des cellules exprimant les anticorps conventionnels de réseau de la lourd-lumière, alors qu'IgM+Igk- sont en grande partie Igl+ en GRAMMAGE (non montré) ou cellules de B à chaîne unique d'anticorps dans le nanomice. (c) Analyse de cytométrie de flux des cellules spléniques du nanomice non immunisé et immunisé et les contrôles souillés avec les bornes centrales germinales CD95 et IgG1. (d) Camemberts montrant à VHH le hypermutation somatique dans le nanomice non immunisé et immunisé. Les segments de secteur sont proportionnels aux séquences de VHH transportant les mutations indiquées sur la périphérie de la carte. Le cercle moyen contient tout le nombre de séquences et la fréquence de mutation est montrée en gras ci-après.

À cause de leur petite taille, les nanobodies peuvent identifier les crevasses de protéine qui sont inaccessibles aux anticorps conventionnels. Les nanobodies ont l'affinité élevée, plus facile au produit d'utiliser-et. Nanobodies représentent les outils prometteurs pour éviter COVID-19 la mortalité quand des vaccins sont compromis, les chercheurs indiqués.

En dépit des avantages des nanobodies, ceux-ci ne sont pas populairement employés parce que 1) les camelids sont de grands animaux et pour cette raison cher de mettre à jour, particulièrement dans les installations scolaires, et 2) des réactions immunitaires hautement hétérogènes sont trouvées (en raison du manque d'endogamie). Il est difficile réaliser spécificité et diversité élevées par des autres moyens.

Isolement de Nbs contre SARS-CoV-2. (a) Régime d
Isolement de Nbs contre SARS-CoV-2. (a) Régime d'immunisation pour obtenir l'affinité élevée Nbs contre le SARS-CoV-2 RBD du lama et du nanomice. (b) Analyse de BLI des concentrations en différence du grippement RBD immobilisé du monomère Nb17 et du trimère. La trace rouge représente les données brutes, et l'ajustement cinétique est montré dans le gris dessous. Des constantes de l'équilibre (KD) sont fournies. (c) Ajournez récapituler le pouvoir de neutralisation de pseudovirus (IC50) de Nbs sélecté. Des valeurs sont fournies dans le molarity ou comme ng/ml. (d) Tableaux montrant Nbs utilisé dans des analyses de neutralisation comme monomères, bivalent ou trimères (les deux derniers ont protégé par fusible à IgG humain Fc par l'intermédiaire du domaine de charnière d'être humain ou de lama. (e) La neutralisation du pseudovirus SARS-CoV-2 (analyse de luciferase) par les 20 variantes de NOTA: montrées dans la Commission C. Nb12 comme monomère (rouge), les paires (bleu-vert) et le trimère (magenta), ainsi que les Nb19 comme trimère (bleu) sont mis en valeur.

Par conséquent, dans cette étude, les chercheurs ont produit le Nbs chez les souris en combinant le dromadaire 18 l'alpaga, 7, et 5 gènes du chameau VHH dans un magasin de la mise en place 25Kb. Ils ont protégé par fusible chaque gène à un promoteur fonctionnel de la souris VH, aux exons de chef, et à une séquence en aval de signe de recombinaison (RSS) pour assurer l'expression et la recombinaison physiologiques.

« Au moyen de CRISPR-Cas9 et échange recombinase-assisté de magasin (RMCE), le magasin de VHH a été inséré au lieu de le lieu entier de VH en cellules de la souris es. »

Ici, les chimères de souris ont été dérivées des cellules d'es, et l'allèle visé était lignée germinale communiquée à la progéniture F1, à la laquelle elles se sont référée comme nanomice dans l'étude.

La recherche a constaté qu'une grande part de cellules de B de nanomouse ont développé exprimer les anticorps à chaîne unique. Ils ont conclu que tous les gènes de VHH dans le nanomice subissent la recombinaison de V (D) J et sont ainsi potentiellement procurables pour l'extension pendant la réaction immunitaire adaptative.

Basé sur leurs résultats, ils ont également conclu que les cellules de B de souris pourraient mûrir, exprimant les anticorps à chaîne unique. Ils ont trouvé l'excellentes activation des cellules de B et maturation d'affinité dans le nanomice.

Les chercheurs ont également vérifié les construire multimeric avec de ces nanobodies et ont trouvé l'avidité remarquable - le meilleur rapporté jusqu'à présent pour anti-SARS-CoV2 Nbs. Ils également rapportés que ces nanobodies multimeric ont efficacement surmonté les mutants de l'évasion SARS-CoV-2.

Pour obtenir une compréhension structurelle des régions de neutralisation identifiées par le nanomouse et le lama Nbs, les chercheurs ont entrepris une étude 3D à microscope électronique des nanobodies dans le composé avec la protéine de pointe. Ces reconstructions ont indiqué le lama que les nanobodies visent uniformément la surface adjacente d'ACE2-binding, alors que les nanobodies de nanomouse identifient le RBD sur une surface en dehors du site d'ACE2-binding.

En conclusion, les chercheurs ont mis en valeur la cotisation essentielle de leur étude à la création des souris productrices de NOTA:. Notamment, les chercheurs mettent l'accent sur que si ce modèle remonte éventuel l'utilisation des camelids dans la recherche biomédicale, alors les lamas et les alpaga sont protégés, qui autrement sont invariablement cueillis dans des fermes de production d'anticorps après une étude donnée.

Ils ont indiqué dans leur étude qui comme épreuve de principe, nous a employé le nanomice pour produire les nanobodies hautement spécifiques contre le SARS-CoV-2 RBD. En raison de leur souplesse d'utilisation et capacité pour le multivalency, ces anti-RBD nanobodies peuvent surmonter des mutations possibles se produisant ou autour derrière le motif ACE2 obligatoire. Cette étude a isolé et a caractérisé deux ensembles de nanobodies qui neutralisent effectivement les virus pseudotyped transportant des mutations de RBD DU R-U et les sud - Africain - des variantes neuves de York.

« Le Nbs décrit ici résolvent le défi lancé par des variantes de l'évasion SARS-CoV-2 l'un ou l'autre par l'avidité améliorée en tant qu'éléments homotrimeric ou en grippant des épitopes économisés en général indisponibles aux anticorps monoclonaux humains. »

Journal reference:
  • Multimeric nanobodies from camelid engineered mice and llamas potently neutralize SARS-CoV-2 variants, Jianliang Xu, Kai Xu, Seolkyoung Jung, Andrea Conte, Jenna Lieberman, Frauke Muecksch, Julio Cesar Cetrulo Lorenzi, Solji Park, Zijun Wang, Lino Tessarollo, Tatsiana Bylund, Gwo-Yu Chuang, Adam S. Olia, Tyler Stephens, I-Ting Teng, Yaroslav Tsybovsky, Tongqing Zhou, Theodora Hatziioannou, Paul D. Bieniasz, Michel C. Nussenzweig, Peter D. Kwong, Rafael Casellas, bioRxiv, 2021.03.04.433768; doi: https://doi.org/10.1101/2021.03.04.433768, https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.03.04.433768v1
Dr. Ramya Dwivedi

Written by

Dr. Ramya Dwivedi

Ramya has a Ph.D. in Biotechnology from the National Chemical Laboratories (CSIR-NCL), in Pune. Her work consisted of functionalizing nanoparticles with different molecules of biological interest, studying the reaction system and establishing useful applications.

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