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La ricerca dimostra le mutazioni di variante sormontate nanobodies multivalent SARS-CoV-2

Dall'inizio di coronavirus) della pandemia COVID-19 (malattia 2019 alla fine del dicembre 2019, il coronavirus eziologico 2 (SARS-CoV-2) di sindrome respiratorio acuto severo dell'agente di questa malattia ha causato più di 2,6 milione morti universalmente oltre da 117 milione infezioni riferite. Tuttavia, mentre i nuovi vaccini sono amministrati contro lo sforzo ancestrale, molte varianti mutate del virus stanno emergendo attraverso il mondo.

Per sviluppare le strategie complementari state necessarie urgentemente per evitare tutta la fuga virale, i ricercatori stanno usando i metodi alternativi. Nanobodies sta ritirando recentemente l'attenzione come alternative terapeutiche potenti.

In un documento recente della pubblicazione preliminare del bioRxiv*, i ricercatori hanno isolato i nanobodies anti--RBD dai lama e “dal nanomice„ (hanno costruito per produrre VHHs clonato dalle alpaghe, dai dromedari e dai cammelli). Nello studio, hanno identificato due insiemi dei nanobodies altamente di neutralizzazione - uno che ha riconosciuto una regione fuori del sito di ACE2-binding e l'altro esclusivamente ha messo a fuoco sul RBD (dominio obbligatorio del ricevitore) - ACE2 (interfaccia dell'enzima di conversione dell'angiotensina 2), non riuscente a neutralizzare gli pseudoviruses che portano le sostituzioni di N501Y o di E484.

La busta SARS-CoV-2 coronated con la punta della glicoproteina, permettendo all'entrata del virus nelle cellule umane ospite. La proteina di S lega al ACE2 sulle cellule ospiti via il RBD.

L'alta affinità di RBD da legare al ACE2 è alla base di più alto transmissibility di SARS-CoV-2. Di conseguenza, questa regione è l'obiettivo di progettazione gli anticorpi e dei vaccini efficaci.

Nanobodies è minuscolo, proteine dell'antigene-associazione. Questi sono domini variabili (frammenti di VHH) degli anticorpi solo catena pesanti (HCAbs) isolati dai camelids. Confrontato agli anticorpi dell'essere umano e del mouse (kDa ~150 nella dimensione), i nanobodies sono i domini variabili degli anticorpi solo catena pesanti dei camelids che conservano la specificità completa dell'antigene ad un peso molecolare del kDa ~15.

Produzione e caratterizzazione del nanomice. (A) 30 VHHs sono stati scelti da alpaga, dal dromedario e dal cammello per creare un caricatore 35mm, che è stato inserito via CRISPR-Cas9 invece del luogo del mouse VH (2.5MB nella dimensione). L
Produzione e caratterizzazione del nanomice. (A) 30 VHHs sono stati scelti da alpaga, dal dromedario e dal cammello per creare un caricatore 35mm, che è stato inserito via CRISPR-Cas9 invece del luogo del mouse VH (2.5MB nella dimensione). L'esone CH1 di Cμ e di Cg1 egualmente è stato cancellato per evitare misfolding della catena pesante dell'anticorpo una volta incapace di accoppiare con le catene leggere. (B) analisi di citometria a flusso dei linfociti B splenici di B220+ da PESO o dal nanomice eterozigotico. IgM+Igk+ rappresentano le celle che esprimono gli anticorpi convenzionali della catena dell'pesante-indicatore luminoso, mentre IgM+Igk- sono principalmente Igl+ in PESO (non indicato) o linfociti B a catena semplice dell'anticorpo in nanomice. (C) analisi di citometria a flusso delle celle spleniche dal nanomice non immunizzato ed immunizzato e comandi macchiati con gli indicatori concentrare germinali CD95 e IgG1. (D) diagrammi a torta che mostrano a VHH hypermutation somatico nel nanomice non immunizzato ed immunizzato. I segmenti del grafico a torta sono proporzionali alle sequenze di VHH che portano le mutazioni indicate sulla periferia del diagramma. Il cerchio medio contiene il numero totale delle sequenze e la frequenza di mutazione è indicata in stampato in neretto sotto.

A causa del loro di piccola dimensione, i nanobodies possono riconoscere le crepe della proteina che sono inaccessibili agli anticorpi convenzionali. I nanobodies hanno alta affinità, più facile usare e produrre. Nanobodies rappresenta gli strumenti di promessa per impedire COVID-19 la mortalità quando i vaccini sono compromessi, i ricercatori indicati.

Malgrado i vantaggi dei nanobodies, questi non sono usati popolare perché 1) i camelids sono grandi animali e quindi costoso mantenere, particolarmente negli impianti accademici e 2) le risposte immunitarie altamente eterogenee sono trovate (dovuto mancanza di accoppiamento). L'alte specificità e diversità sono difficili da raggiungere attraverso altri mezzi.

Isolamento di Nbs contro SARS-CoV-2. (A) Regime di immunizzazione per ottenere alta affinità Nbs contro il SARS-CoV-2 RBD dal lama e dal nanomice. (B) l
Isolamento di Nbs contro SARS-CoV-2. (A) Regime di immunizzazione per ottenere alta affinità Nbs contro il SARS-CoV-2 RBD dal lama e dal nanomice. (B) l'analisi di BLI delle concentrazioni in differenza dell'associazione del monomero Nb17 e del trimero ha vincolato RBD. La traccia rossa rappresenta i dati grezzi e la misura cinetica è indicata nel grey sotto. Le costanti di equilibrio (KD) sono fornite. (C) Tabella che riassume potenza di neutralizzazione di pseudovirus (IC50) di Nbs selezionato. I valori sono forniti in molarità o come ng/ml. (D) Diagrams la mostra del Nbs utilizzato nelle analisi di neutralizzazione come i monomeri, bivalente o trimeri (gli ultimi due hanno fuso all'essere umano IgG Fc via il dominio della cerniera del lama o dell'essere umano. (E) la neutralizzazione SARS-CoV-2 dello pseudovirus (analisi di luciferase) dalle 20 varianti di N.B.: indicate in comitato C. Nb12 come monomero (rosso), le paia (ciano) ed il trimero (magenta) come pure Nb19 come trimero (blu) sono evidenziati.

Di conseguenza, in questo studio, i ricercatori hanno prodotto il Nbs in mouse combinando dromedario 18 l'alpaga, 7 e 5 geni del cammello VHH in un caricatore 35mm di inserzione 25Kb. Hanno fuso ogni gene ad un promotore funzionale del mouse VH, agli esoni della guida e ad una sequenza a valle del segnale di ricombinazione (RSS) per assicurare l'espressione e la ricombinazione fisiologiche.

“Per mezzo di CRISPR-Cas9 e scambio recombinase-mediato di caricatore 35mm (RMCE), il caricatore 35mm di VHH è stato inserito invece di intero luogo di VH in celle del mouse es.„

Qui, le chimere del mouse sono state derivate dalle celle di es e l'allele mirato a era germline trasmesso alla prole F1, a che si sono riferite come nanomice nello studio.

La ricerca ha trovato che una grande frazione dei linfociti B del nanomouse ha sviluppato l'espressione degli anticorpi a catena semplice. Hanno concluso che tutti i geni di VHH in nanomice subiscono la ricombinazione di V (D) J e sono così potenzialmente disponibili per espansione durante la risposta immunitaria adattabile.

Sulla base dei loro risultati, egualmente hanno concluso che i linfociti B del mouse potrebbero maturare, esprimendo gli anticorpi a catena semplice. Hanno trovato l'attivazione del linfocita B e la maturazione eccellenti di affinità nel nanomice.

I ricercatori egualmente hanno verificato le costruzioni multimeric di questi nanobodies ed hanno trovato l'avidità notevole - il meglio riferito fin qui per anti-SARS-CoV2 Nbs. Egualmente hanno riferito che questi nanobodies multimeric hanno sormontato efficientemente i mutanti di fuga SARS-CoV-2.

Per ottenere una comprensione strutturale delle regioni di neutralizzazione riconosciute da nanomouse e dal lama Nbs, i ricercatori hanno intrapreso gli studi al microscopio elettronico 3D dei nanobodies nel complesso con la proteina della punta. Queste ricostruzioni hanno rivelato il lama che i nanobodies mirano costante all'interfaccia di ACE2-binding, mentre i nanobodies del nanomouse riconoscono il RBD ad una superficie fuori del sito di ACE2-binding.

In conclusione, i ricercatori hanno evidenziato il contributo essenziale del loro studio alla creazione dei mouse producenti N.B.:. Considerevolmente, i ricercatori sottolineano che se questo modello infine sostituisce l'uso dei camelids nella ricerca biomedica, quindi i lama e le alpaghe sono protetti, che sono selezionati altrimenti invariabilmente nelle aziende agricole di produzione dell'anticorpo dopo che uno studio dato.

Hanno specificato nel loro studio che come prova del principio, noi ha usato il nanomice per produrre i nanobodies altamente specifici contro il SARS-CoV-2 RBD. dovuto la loro versatilità e capacità per il multivalency, questi nanobodies anti--RBD possono sormontare le mutazioni possibili che accadono a o intorno al motivo obbligatorio ACE2. Questo studio ha isolato e caratterizzato due insiemi dei nanobodies che efficacemente neutralizzano i virus pseudotyped che portano le mutazioni di RBD dal Regno Unito e dal sud - Africano - varianti di New York.

“Il Nbs descritto qui risolve la sfida posata dalle varianti di fuga SARS-CoV-2 l'uno o l'altro con l'avidità migliorata come costruzioni homotrimeric o legando gli epitopi conservati in genere non disponibili agli anticorpi monoclonali umani.„

Journal reference:
  • Multimeric nanobodies from camelid engineered mice and llamas potently neutralize SARS-CoV-2 variants, Jianliang Xu, Kai Xu, Seolkyoung Jung, Andrea Conte, Jenna Lieberman, Frauke Muecksch, Julio Cesar Cetrulo Lorenzi, Solji Park, Zijun Wang, Lino Tessarollo, Tatsiana Bylund, Gwo-Yu Chuang, Adam S. Olia, Tyler Stephens, I-Ting Teng, Yaroslav Tsybovsky, Tongqing Zhou, Theodora Hatziioannou, Paul D. Bieniasz, Michel C. Nussenzweig, Peter D. Kwong, Rafael Casellas, bioRxiv, 2021.03.04.433768; doi: https://doi.org/10.1101/2021.03.04.433768, https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.03.04.433768v1
Dr. Ramya Dwivedi

Written by

Dr. Ramya Dwivedi

Ramya has a Ph.D. in Biotechnology from the National Chemical Laboratories (CSIR-NCL), in Pune. Her work consisted of functionalizing nanoparticles with different molecules of biological interest, studying the reaction system and establishing useful applications.

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