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La investigación demuestra mutaciones vencidas los nanobodies polivalentes de la variante SARS-CoV-2

Desde el comienzo (enfermedad 2019 del coronavirus) del pandémico COVID-19 a finales de diciembre de 2019, el coronavirus etiológico 2 (SARS-CoV-2) de la neumonía asiática del agente de esta enfermedad ha causado más de 2,6 millones de muertes por todo el mundo sobre de 117 millones de infecciones denunciadas. Sin embargo, como las nuevas vacunas se administran contra la deformación ancestral, muchas variantes transformadas del virus están emergiendo a través del mundo.

Para desarrollar las estrategias complementarias necesarias urgente para evitar cualquier escape viral, los investigadores están utilizando enfoques alternativos. Nanobodies está drenando la atención recientemente como opciones terapéuticas potentes.

En un papel reciente de la prueba preliminar del bioRxiv*, los investigadores aislaron nanobodies antis-RBD de llamas y del “nanomice” (dirigieron para producir VHHs reproducido de alpacas, de dromedarios y de camellos). En el estudio, determinaron dos equipos de los nanobodies altamente de neutralización - uno que reconoció una región fuera del sitio de ACE2-binding, y el otro se centró exclusivamente en el RBD (dominio obligatorio del receptor) - ACE2 (angiotensina-convirtiendo el interfaz de la enzima 2), no pudiendo neutralizar los pseudoviruses que llevan las substituciones de E484 o de N501Y.

El envolvente SARS-CoV-2 coronated con el pico de la glicoproteína, habilitando el asiento del virus en las células humanas del ordenador principal. La proteína de S ata al ACE2 en las células huesped vía el RBD.

La alta afinidad de RBD a atar al ACE2 es la base de la transmisibilidad más alta de SARS-CoV-2. Por lo tanto, esta región es el objetivo de diseñar los anticuerpos y las vacunas efectivos.

Nanobodies es proteínas minúsculas, antígeno-obligatorias. Éstos son dominios variables (fragmentos de VHH) de los anticuerpos pesados de la cadena-solamente (HCAbs) aislados de camelids. Comparado a los anticuerpos del ratón y del ser humano (kDa ~150 de tamaño), los nanobodies son los dominios variables de los anticuerpos pesados de la cadena-solamente de los camelids que conservan especificidad completa del antígeno en un peso molecular del kDa ~15.

Producción y caracterización del nanomice. (a) 30 VHHs fue seleccionado de alpaca, de dromedario y de camello para crear un magazín, que fue insertado vía CRISPR-Cas9 en lugar del lugar geométrico del ratón VH (2.5MB de tamaño). El exón CH1 de Cμ y de Cg1 también fue suprimido para evitar misfolding de la cadena pesada del anticuerpo cuando es incapaz de emparejar con las cadenas livianas. (b) Análisis del cytometry de flujo de las células de B esplénicas de B220+ del PESO o del nanomice heterozigótico. IgM+Igk+ representan las células que expresan los anticuerpos convencionales de la cadena de la pesado-luz, mientras que IgM+Igk- son sobre todo Igl+ en el PESO (no mostrado) o las células de B de cadena simple del anticuerpo en nanomice. (c) Análisis del cytometry de flujo de las células esplénicas del nanomice sin inmunizar e inmunizado y mandos manchados con los marcadores de centro germinales CD95 e IgG1. (d) Gráficos circulares que muestran a VHH el hypermutation somático en nanomice sin inmunizar e inmunizado. Los segmentos de la empanada son proporcionales a las series de VHH que llevan las mutaciones indicadas en la periferia de la carta. El círculo central contiene el número total de series y la frecuencia de la mutación se muestra en intrépido abajo.
Producción y caracterización del nanomice. (a) 30 VHHs fue seleccionado de alpaca, de dromedario y de camello para crear un magazín, que fue insertado vía CRISPR-Cas9 en lugar del lugar geométrico del ratón VH (2.5MB de tamaño). El exón CH1 de Cμ y de Cg1 también fue suprimido para evitar misfolding de la cadena pesada del anticuerpo cuando es incapaz de emparejar con las cadenas livianas. (b) Análisis del cytometry de flujo de las células de B esplénicas de B220+ del PESO o del nanomice heterozigótico. IgM+Igk+ representan las células que expresan los anticuerpos convencionales de la cadena de la pesado-luz, mientras que IgM+Igk- son sobre todo Igl+ en el PESO (no mostrado) o las células de B de cadena simple del anticuerpo en nanomice. (c) Análisis del cytometry de flujo de las células esplénicas del nanomice sin inmunizar e inmunizado y mandos manchados con los marcadores de centro germinales CD95 e IgG1. (d) Gráficos circulares que muestran a VHH el hypermutation somático en nanomice sin inmunizar e inmunizado. Los segmentos de la empanada son proporcionales a las series de VHH que llevan las mutaciones indicadas en la periferia de la carta. El círculo central contiene el número total de series y la frecuencia de la mutación se muestra en intrépido abajo.

Debido a su tamaño pequeño, los nanobodies pueden reconocer las hendeduras de la proteína que son inaccesibles a los anticuerpos convencionales. Los nanobodies tienen alta afinidad, más fácil utilizar y producir. Nanobodies representa las herramientas prometedoras para prevenir COVID-19 la mortalidad cuando se comprometen las vacunas, los investigadores declarados.

A pesar de las ventajas de los nanobodies, éstos no se utilizan popular porque 1) los camelids son animales grandes y por lo tanto costoso mantener, especialmente en instalaciones académicas, y 2) se encuentran las inmunorespuestas altamente heterogéneas (debido a la falta de endogamia). La altas especificidad y diversidad son difíciles de lograr por otros medios.

Aislamiento de Nbs contra SARS-CoV-2. (a) Régimen de la inmunización para obtener la alta afinidad Nbs contra el SARS-CoV-2 RBD de la llama y del nanomice. (b) Análisis de BLI de las concentraciones de la diferencia del atascamiento RBD inmovilizado del monómero Nb17 y del trímero. El trazo rojo representa las informaciones en bruto, y el ajuste cinético se muestra en gris debajo. Se ofrecen los constantes del equilibrio (KD). (c) Presente resumir la potencia de la neutralización del pseudovirus (IC50) de Nbs seleccionado. Los valores se ofrecen en molarity o como ng/ml. (d) Diagramas que muestran Nbs usado en análisis de la neutralización como los monómeros, bivalente o trímeros (los dos pasados fundieron al ser humano IgG Fc vía el dominio de la charnela del ser humano o de la llama. (e) La neutralización del pseudovirus SARS-CoV-2 (análisis del luciferase) por las 20 variantes de la NOTA mostradas en el panel C. Nb12 como monómero (rojo), los pares (color cianita) y el trímero (magenta), así como Nb19 como trímero (azul) se destacan.
Aislamiento de Nbs contra SARS-CoV-2. (a) Régimen de la inmunización para obtener la alta afinidad Nbs contra el SARS-CoV-2 RBD de la llama y del nanomice. (b) Análisis de BLI de las concentraciones de la diferencia del atascamiento RBD inmovilizado del monómero Nb17 y del trímero. El trazo rojo representa las informaciones en bruto, y el ajuste cinético se muestra en gris debajo. Se ofrecen los constantes del equilibrio (KD). (c) Presente resumir la potencia de la neutralización del pseudovirus (IC50) de Nbs seleccionado. Los valores se ofrecen en molarity o como ng/ml. (d) Diagramas que muestran Nbs usado en análisis de la neutralización como los monómeros, bivalente o trímeros (los dos pasados fundieron al ser humano IgG Fc vía el dominio de la charnela del ser humano o de la llama. (e) La neutralización del pseudovirus SARS-CoV-2 (análisis del luciferase) por las 20 variantes de la NOTA mostradas en el panel C. Nb12 como monómero (rojo), los pares (color cianita) y el trímero (magenta), así como Nb19 como trímero (azul) se destacan.

Por lo tanto, en este estudio, los investigadores produjeron el Nbs en ratones combinando el dromedario 18 la alpaca, 7, y 5 genes del camello VHH en un magazín de la inserción 25Kb. Fundieron cada gen a un promotor funcional del ratón VH, a exones del líder, y a una serie rio abajo de la señal de la recombinación (RSS) para asegurar la expresión y la recombinación fisiológicas.

“Mediante CRISPR-Cas9 y cantina recombinase-mediada del magazín (RMCE), el magazín de VHH fue insertado en lugar del lugar geométrico entero de VH en células del ES del ratón.”

Aquí, las quimeras del ratón fueron derivadas de las células del ES, y el alelo apuntado era germline transmitido al descendiente F1, a que él refirió como nanomice en el estudio.

La investigación encontró que una gran parte de células de B del nanomouse desarrollaron la expresión de los anticuerpos de cadena simple. Concluyeron que todos los genes de VHH en nanomice experimentan la recombinación de V (D) J y están así potencialmente disponibles para la extensión durante la inmunorespuesta adaptante.

De acuerdo con sus resultados, también concluyeron que las células de B del ratón podrían madurarse, expresando los anticuerpos de cadena simple. Encontraron la activación del linfocito B y la maduración excelentes de la afinidad en el nanomice.

Los investigadores también probaron las construcciones multimeric de estos nanobodies y encontraron la avidez notable - el mejor denunciado hasta la fecha para anti-SARS-CoV2 Nbs. También denunciaron que estos nanobodies multimeric vencieron eficientemente los mutantes del escape SARS-CoV-2.

Para obtener una comprensión estructural de las regiones de neutralización reconocidas por el nanomouse y la llama Nbs, los investigadores conducto un estudio de microscopio electrónico 3D de los nanobodies en complejo con la proteína del pico. Estas reconstrucciones revelaron la llama que los nanobodies apuntan uniformemente el interfaz de ACE2-binding, mientras que los nanobodies del nanomouse reconocen el RBD en una superficie fuera del sitio de ACE2-binding.

En conclusión, los investigadores destacaron la contribución esencial de su estudio a la creación de ratones NOTA-que producían. Notablemente, los investigadores acentúan que si este modelo reemplaza final el uso de camelids en la investigación biomédica, después se protegen las llamas y las alpacas, que se seleccionan de otra manera invariable en granjas de la producción del anticuerpo después de que un estudio dado.

Declararon en su estudio que como prueba del principio, nosotros utilizó el nanomice para producir nanobodies altamente específicos contra el SARS-CoV-2 RBD. Debido a su flexibilidad y capacidad para el multivalency, estos nanobodies antis-RBD pueden vencer las mutaciones posibles que ocurren en o alrededor del adorno obligatorio ACE2. Este estudio ha aislado y ha caracterizado dos equipos de los nanobodies que neutralizan efectivo los virus pseudotyped que llevan mutaciones de RBD de Reino Unido y del sur - africano - las nuevas variantes de York.

“El Nbs descrito aquí resuelve el reto planteado por variantes del escape SARS-CoV-2 cualquiera con avidez aumentada como construcciones homotrimeric o atando los epitopos conservados típicamente inasequibles a los anticuerpos monoclonales humanos.”

Journal reference:
  • Multimeric nanobodies from camelid engineered mice and llamas potently neutralize SARS-CoV-2 variants, Jianliang Xu, Kai Xu, Seolkyoung Jung, Andrea Conte, Jenna Lieberman, Frauke Muecksch, Julio Cesar Cetrulo Lorenzi, Solji Park, Zijun Wang, Lino Tessarollo, Tatsiana Bylund, Gwo-Yu Chuang, Adam S. Olia, Tyler Stephens, I-Ting Teng, Yaroslav Tsybovsky, Tongqing Zhou, Theodora Hatziioannou, Paul D. Bieniasz, Michel C. Nussenzweig, Peter D. Kwong, Rafael Casellas, bioRxiv, 2021.03.04.433768; doi: https://doi.org/10.1101/2021.03.04.433768, https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.03.04.433768v1
Dr. Ramya Dwivedi

Written by

Dr. Ramya Dwivedi

Ramya has a Ph.D. in Biotechnology from the National Chemical Laboratories (CSIR-NCL), in Pune. Her work consisted of functionalizing nanoparticles with different molecules of biological interest, studying the reaction system and establishing useful applications.

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