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I ricercatori sviluppano il biosensore innovatore che può individuare e quantificare l'infezione SARS-CoV-2

Gli atti di una droga o di un obiettivo molecolare in vitro fanno spesso non tradotto in cellulare o in vivo in contesto. La permeabilità della membrana, gli effetti dell'fuori obiettivo e la citotossicità sono alcuni dei fattori che possono contribuire a questa differenza. Ciò è un grave ostacolo enorme nello sforzo per identificare urgentemente le terapie antivirali innovarici, particolarmente come conseguenza della pandemia di malattia 2019 di coronavirus (COVID-19).

L'agente eziologico di COVID-19 è coronavirus 2 (SARS-CoV-2) di sindrome respiratorio acuto severo. Ha infettato oltre 123,5 milione vite e causato oltre 2,7 milione morti. Il solo agente antivirale di promessa contro SARS-CoV-2 corrente utilizzato nella clinica è il remdesivir RNA-dipendente dell'inibitore del RNA polimerasi. Tuttavia, ha presentato i risultati misti e gli effetti collaterali.

Mentre gli efficaci vaccini contro il SARS-CoV-2 ora stanno amministrandi in molte parti del mondo, è sospettato che il virus può persistere e continuare ad infettare gli esseri umani. Inoltre, le varianti emergenti possono contribuire alla circolazione ed all'infezione del virus.

Per combattere questo scoppio SAR-CoV-2 e tutti i coronaviruses zoonotici futuri potenziali, è essenziale per avere strumenti efficienti - diriga le analisi biochimiche - che fornisca il dato più fisiologicamente valido e permetta lo studio sui fenotipi terziari complessi quale la replicazione virale.

Corrente, le prove di neutralizzazione convenzionali di riduzione della placca (PRNT) sono il sistema monetario aureo per la quantificazione della replicazione virale. Tuttavia, la capacità di lavorazione bassa ed il tempo complessivo lungo di queste analisi limitano la loro utilità per selezione su grande scala delle droghe o dei sieri.

Per soddisfare un bisogno urgente per ad un'analisi basata a cella di alto-capacità di lavorazione e semplice, quantificare l'infezione autentica SARS-CoV-2 e le nuove varianti cliniche, i ricercatori hanno sfruttato la presenza di attività virale della proteasi. Le proteasi SARS-CoV-2 sono obiettivi terapeutici attraenti.

In un nuovo studio pubblicato recentemente sul " server " del bioRxiv*, hanno generato i biosensori fluorescenti e luminescenti della proteasi-activatable per attività di SARS-CoV-2 MPro (proteasi principale) e di PLPro (proteasi del tipo di papaina), una basata “sulla vibrazione„ GFP (FlipGFP) e l'altra basata sul luciferase circolarmente permutato della lucciola (FFluc). Il gruppo, dall'università di Cambridge ed il sangue ed il trapianto di NHS, Cambridge, Regno Unito, ha sviluppato una linea cellulare luminescente sensibile del reporter che quantifica esattamente il virus contagioso SARS-CoV-2.

Rispetto ai virus fluorescenti o luminescenti inverso-costruiti del reporter, un vantaggio chiave della nostra linea cellulare luminescente del reporter è il potenziale di individuare un intervallo degli isolati clinici SARS-CoV-2, compreso le varianti emergenti di preoccupazione.„

I ricercatori hanno confermato la specificità e l'utilità di questi reporter che usando le proteasi virali recombinanti. Hanno stabilito che questi reporter potrebbero individuare e quantificare le celle infettate.

Per concludere, hanno sviluppato una linea cellulare stabile e luminescente del reporter, in cui il FFluc è attivato dall'espressione di PLPro durante l'infezione SARS-CoV-2. Hanno dimostrato l'utilità di queste celle nelle analisi di piccoli antivirals della molecola e degli anticorpi di neutralizzazione facendo uso di un tipo selvaggio SARS-CoV-2.

In questo lavoro, hanno dimostrato la sua utilità per la selezione della droga e la titolazione degli anticorpi di neutralizzazione.

Dopo che i ricercatori hanno generato ai i reporter basati FlipGFP della proteasi SARS-CoV-2, hanno provato se questi biosensori potessero individuare l'attività della proteasi SARS-CoV-2 in celle. Dei tre reporter studiati qui, hanno osservato il più forte segnale dal reporter di PLP2-FlipGFP.

Più ulteriormente, egualmente hanno confermato che i biosensori selezionati SARS-CoV-2 sono specifici per le loro proteasi della parola affine ed attivato in un modo rigorosamente sequenza-dipendente.

I dati in questo studio hanno supportato il principio che ad analisi basate a cella per i composti antivirali correlano meglio con attività contro la replicazione virale che in vitro le analisi, i ricercatori indicati.

Facendo uso della linea cellulare ACE2 d'espressione di HEK293T e del furin (chiamato le celle HEK293T-ACE2), i ricercatori hanno dimostrato che durante l'infezione SARS-CoV-2, l'espressione virale della proteasi ha attivato ai i reporter basati FlipGFP. Così i biosensori della proteasi-activatable possono essere sfruttati per segnalare l'infezione SARS-CoV-2. Tuttavia, lo studio ha precisato che non è riuscito a dimostrare una finestra utilizzabile per gli esperimenti di alto-capacità di lavorazione.

Hanno generato ad un reporter basato luciferase della proteasi SARS-CoV-2 che può quantificare l'infezione SARS-CoV-2 ed egualmente hanno sviluppato un'analisi luminescente facile per la schermatura degli inibitori della replica SARS-CoV-2.

Facendo uso di questa a analisi basata a cella, i ricercatori si sono differenziati, da un comitato degli inibitori, fra i composti che possono inibire la replicazione virale (GC373 e GC376) e quelli che non sono (carmofur, disulfiram, PX-12, tideglusib).

Per una linea cellulare luminescente sensibile del reporter per la droga, la neutralizzazione e le analisi virologiche generali, i ricercatori poi hanno sviluppato una linea cellulare stabile, le celle HEK293T-ACE2-30F-PLP2; usato con una lettura luminescente semplice.

La prima linea cellulare stabile e luminescente del reporter per l'infezione SARS-CoV-2 generata in questo studio è adatta idealmente agli schermi di alto-capacità di lavorazione dei composti antivirali del candidato o degli anticorpi terapeutici e/o alle indagini sierologiche su grande scala per attività di neutralizzazione contro il virus autentico.

In conclusione, i ricercatori in questo studio hanno sviluppato un toolkit versatile ai dei reporter fluorescenti e luminescenti basati a cella attivati dalle proteasi SARS-CoV-2.

I nostri dati stabiliscono la possibilità di biosensori activatable della proteasi per la rilevazione dell'infezione SARS-CoV-2 e dimostrano l'utilità pratica ad una di una linea cellulare basata luciferase del reporter per quantificazione delle celle infettate, della prova della droga e delle analisi sierologiche.„

Avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
Dr. Ramya Dwivedi

Written by

Dr. Ramya Dwivedi

Ramya has a Ph.D. in Biotechnology from the National Chemical Laboratories (CSIR-NCL), in Pune. Her work consisted of functionalizing nanoparticles with different molecules of biological interest, studying the reaction system and establishing useful applications.

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