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Os pesquisadores desenvolvem o biosensor inovativo que pode detectar e dosar a infecção SARS-CoV-2

As acções de uma droga ou de um alvo molecular in vitro fazem frequentemente não traduzido em um celular ou in vivo em um contexto. A permeabilidade de membrana, os efeitos do fora-alvo, e a citotoxidade são alguns dos factores que podem contribuir a esta diferença. Este é um gargalo enorme no esforço para identificar urgente terapias antivirosas novas, especialmente como consequência da pandemia da doença 2019 do coronavirus (COVID-19).

O agente etiological de COVID-19 é o coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2). Contaminou sobre 123,5 milhão vidas, e causado sobre 2,7 milhão mortes. O único agente antiviroso o mais prometedor contra SARS-CoV-2 usado actualmente na clínica é o remdesivir RNA-dependente do inibidor da polimerase de RNA. Contudo, apresentou resultados mistos e efeitos secundários.

Quando as vacinas eficazes contra o SARS-CoV-2 forem administradas agora em muitas partes do mundo, suspeita-se que o vírus pode persistir e continuar a contaminar seres humanos. Também, as variações emergentes podem contribuir à circulação e à infecção do vírus.

Para lutar esta manifestação SAR-CoV-2 e todos os coronaviruses zoonotic futuros potenciais, é essencial ter ferramentas eficientes - dirija ensaios bioquímicos - que forneça a informação mais physiologically relevante e permita o estudo de fenótipos terciários complexos tais como a réplica viral.

Actualmente, os testes de neutralização convencionais da redução da chapa (PRNT) são a bandeira de ouro para a quantificação da réplica viral. Contudo, a baixa produção e o tempo de resposta longo destes ensaios limitam seu serviço público para a selecção em grande escala das drogas ou dos soros.

Para encontrar uma necessidade urgente para um ensaio baseado em celulas simples, da alto-produção, dosar a infecção SARS-CoV-2 autêntica e variações clínicas novas, os pesquisadores exploraram a presença de actividade viral do protease. Os proteases SARS-CoV-2 são alvos terapêuticos atractivos.

Em um estudo novo publicado recentemente no server do bioRxiv*, geraram biosensors fluorescentes e luminescentes do protease-activatable para a actividade de SARS-CoV-2 MPro (protease principal) e de PLPro (papain-como o protease), a uma baseada na “aleta” GFP (FlipGFP), e a outro baseada no luciferase circular permutado do vaga-lume (FFluc). A equipe, da universidade de Cambridge e o sangue e transplantação do NHS, Cambridge, Reino Unido, desenvolveu uma linha celular luminescente sensível do repórter que dosasse exactamente o vírus SARS-CoV-2 infeccioso.

Comparado com os vírus fluorescentes ou luminescentes reverso-projetados do repórter, uma vantagem chave de nossa linha celular luminescente do repórter é o potencial detectar uma escala dos isolados SARS-CoV-2 clínicos, incluindo variações emergentes do interesse.”

Os pesquisadores confirmaram a especificidade e o serviço público destes repórteres que usam proteases virais de recombinação. Estabeleceram que estes repórteres poderiam detectar e dosar as pilhas contaminadas.

Finalmente, desenvolveram uma linha celular estável, luminescente do repórter, em que o FFluc é activado pela expressão de PLPro durante a infecção SARS-CoV-2. Demonstraram o serviço público destas pilhas nos ensaios de antivirais pequenos da molécula e de anticorpos de neutralização usando um tipo selvagem SARS-CoV-2.

Neste trabalho, demonstraram seu serviço público para a selecção da droga e a titulação de anticorpos de neutralização.

Depois que os pesquisadores gerados FlipGFP-basearam repórteres do protease SARS-CoV-2, testaram se estes biosensors poderiam detectar a actividade do protease SARS-CoV-2 nas pilhas. Dos três repórteres estudados aqui, observaram o sinal o mais forte do repórter de PLP2-FlipGFP.

Mais, igualmente confirmaram que os biosensors SARS-CoV-2 selecionados são específicos para seus proteases cognate, e ativado em uma maneira restrita seqüência-dependente.

Os dados neste estudo apoiaram o princípio que os ensaios baseados em celulas para compostos antivirosos correlacionam melhor com a actividade contra a réplica viral do que in vitro ensaios, pesquisadores indicados.

Usando a linha celular ACE2 sobre-expressando de HEK293T e o furin (chamado as pilhas HEK293T-ACE2), os pesquisadores demonstraram que durante uma infecção SARS-CoV-2, a expressão viral do protease activou os repórteres FlipGFP-baseados. Assim os biosensors do protease-activatable podem ser explorados para sinalizar a infecção SARS-CoV-2. Contudo, o estudo indicou que não demonstrou um indicador útil para experiências da alto-produção.

Geraram um repórter luciferase-baseado do protease SARS-CoV-2 que pudesse dosar a infecção SARS-CoV-2, e igualmente desenvolveram um ensaio luminescente fácil para selecionar os inibidores da réplica SARS-CoV-2.

Usando este ensaio baseado em celulas, os pesquisadores diferenciaram-se, de um painel dos inibidores, entre os compostos que podem inibir a réplica viral (GC373 e GC376) e os aqueles que não são (carmofur, disulfiram, PX-12, tideglusib).

Para uma linha celular luminescente sensível do repórter para a droga, a neutralização e ensaios virological gerais, os pesquisadores desenvolveram então uma linha celular estável, pilhas HEK293T-ACE2-30F-PLP2; usado com um readout luminescente simples.

A primeira linha celular estável, luminescente do repórter para a infecção SARS-CoV-2 gerada neste estudo é serida idealmente às telas da alto-produção de compostos antivirosos do candidato ou de anticorpos terapêuticos, e/ou às avaliações serological em grande escala para a actividade de neutralização contra o vírus autêntico.

Em conclusão, os pesquisadores neste estudo desenvolveram um conjunto de ferramentas versátil dos repórteres fluorescentes e luminescentes baseados em celulas ativados pelos proteases SARS-CoV-2.

Nossos dados estabelecem a possibilidade de biosensors activatable do protease para a detecção da infecção SARS-CoV-2, e demonstram o serviço público prático de uma linha celular luciferase-baseada do repórter para a quantificação de pilhas contaminadas, de teste da droga e de ensaios serological.”

Observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
Dr. Ramya Dwivedi

Written by

Dr. Ramya Dwivedi

Ramya has a Ph.D. in Biotechnology from the National Chemical Laboratories (CSIR-NCL), in Pune. Her work consisted of functionalizing nanoparticles with different molecules of biological interest, studying the reaction system and establishing useful applications.

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