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Selezione per SARS-CoV-2 gli inibitori non strutturali della proteina 14

Il genoma di coronavirus 2 di sindrome respiratorio acuto severo (SARS-CoV-2) genera 16 proteine non strutturali distinte (nsp) che costituiscono una volta gli enzimi e le proteine accessorie responsabili della replica del virus dentro una cellula ospite. Questi complessi della proteina producono e ricoprono i fili del RNA che accenderanno essere tradotti dal macchinario ospite. Ricoprendo il RNA in un modo che è riconosciuto come simile al mRNA endogeno assicura la compatibilità, diminuisce la degradazione del RNA valuta ed abbassa la probabilità dell'avviamento della risposta immunitaria nella cellula ospite.

In un documento recentemente caricato al bioRxiv* del " server " della pubblicazione preliminare da Diffley et al. (8 aprile 2021th), gli inibitori di una proteina non strutturale essenziale SARS-CoV-2 sono esplorati, con quattro composti, in particolare, identificati come cavi antivirali potenziali che esibiscono gli effetti sinergici con il remdesivir antivirale della droga.

La funzione di nsp14

A seguito della sintesi del filo virale del RNA, nsp13 è compreso preparare nel filo per il coperchiamento eliminando il gruppo terminale del fosfato, dopo di che nei trasferimenti nsp12 la struttura del cappuccio di GpppA nel 5' estremità del RNA. Nsp14, nsp16 e nsp10 poi finiscono la struttura del cappuccio aggiungendo parecchi gruppi metilici, formanti Cap1.

Il gruppo ha dimostrato che la metilazione eseguita dal complesso nsp16/nsp10 dipende dalla metilazione priore del filo da nsp14 ed entrambi enzimi richiedono la presenza di S-adenosyl-L-metionina (SAM), un erogatore metilico, producendo l'S-adenosyl-L-omocisteina (SAH) sopra la donazione. Nsp14 è stato indicato per essere un methyltransferase guanine-N7 che può catalizzare soltanto la metilazione della struttura cominciante di GpppA.

Nsp14 è stato depurato ed il gruppo ha sviluppato un'analisi quantifiably per determinare la conversione del SAM a SAH in presenza dell'enzima e GppA-ha ricoperto il RNA, quindi determinante l'attività dell'enzima di methyltransferase. Nsp14 egualmente è stato schermato contro una libreria oltre di 5.000 composti chimici alla ricerca dei cavi antivirali della droga, applicata ad una concentrazione di μM 3,125 e ciascuno si è allineato basato su efficacia. I cavi risultanti della droga più ulteriormente sono stati raffinati eliminando gli errori probabili, i composti che sarebbero difficili alla sorgente, o quelli della selezione con le tossicità conosciute alla concentrazione richiesta indicata.

Depurazione nsp14 del profilo della guanina N7 Methyltransferase a) del genoma SARS-CoV-2. Pp1a e Pp1ab rappresentano i poliproteici a ed ab, rispettivamente. Pp1a e pp1ab possono autoproteolytically fendersi per formare le proteine del nsp descritte. Il complesso virale di replicase/transcriptase produce una serie di RNAs virale intercalato che codifica le proteine virali (verdi) accessorie (arancio) o strutturali. b) Profilo di coperchiamento del RNA virale. Il nucleotide iniziale del RNA possiede un fosfato del β e del γ, a differenza di seguenti basi del RNA. Il fosfato del γ è eliminato da nsp13, seguito dall
Depurazione nsp14 del profilo della guanina N7 Methyltransferase a) del genoma SARS-CoV-2. Pp1a e Pp1ab rappresentano i poliproteici a ed ab, rispettivamente. Pp1a e pp1ab possono autoproteolytically fendersi per formare le proteine del nsp descritte. Il complesso virale di replicase/transcriptase produce una serie di RNAs virale intercalato che codifica le proteine virali (verdi) accessorie (arancio) o strutturali. b) Profilo di coperchiamento del RNA virale. Il nucleotide iniziale del RNA possiede un fosfato del β e del γ, a differenza di seguenti basi del RNA. Il fosfato del γ è eliminato da nsp13, seguito dall'aggiunta del Gp da nsp12, rilasciante il pirofosfato. nsp14 e nsp16/10 poi catalizzano la formazione della struttura definitiva Cap-0. c) Gel di Coomassie di fenditura di His14-SUMO. Colonna sinistra: L'eluizione da Ni-NTA borda senza la proteasi Sumo-dipendente Ulp1. Destra: L'eluizione da Ni-NTA borda dopo il trattamento con Ulp1 (vedi i metodi). d) Frazioni di cromatografia d'esclusione di nsp14. Sinistra: Input a cromatografia d'esclusione. Destra: Frazioni riunite dal picco principale dell'eluizione (più bassa). dimensione prevista nsp14: kDa 55.

Inibitori Nsp14

Un composto chimico definito PF-03882845 è stato trovato per essere l'inibitore più potente, esibente una concentrazione inibitoria 50% di μM 1,1. Trifluperidol, Inauhzin e Lomeguatrib hanno avuti valori IC50 μM 12,9 di μM, 23 e μM 59,8, rispettivamente. L'attività di queste droghe verso il complesso nsp16/nsp10 egualmente è stata provata e nessuno sono stati trovati inibire il complesso, dimostrando la specificità delle droghe verso nsp14.

Le cellule di mammiferi poi sono state infettate con SARS-CoV-2 e gli inibitori applicati, seguito dalla macchiatura fluorescente degli anticorpi della anti-nucleoproteina, permettendo che il gruppo tenga la carreggiata sia il caricamento virale che la citotossicità verso le celle. PF-03882845, Inauhzin e Trifluperidol valori avuti ogni IC50 tra μM 11-13 compreso, per la potenza diminuente, mentre Lomeguatrib ha richiesto una concentrazione di μM quasi 60 per i simili livelli di inibizione. Nessuno delle droghe sono risultato essere citotossiche nella linea cellulare provata.

Il remdesivir antivirale della droga richiede generalmente le concentrazioni di intorno 1 μM di abbassare il caricamento virale nelle celle esaminate dal gruppo. Per verificare la sinergia, la droga era applicata ad una concentrazione di soltanto 0,5 μM congiuntamente ad una delle quattro droghe del cavo. In questo caso, Inauhzin ha esibito i simili valori IC50 quando solo applicato, mentre le tre altre droghe hanno esibito la sinergia significativa, avendo valori considerevolmente più bassi IC50. Il IC50 di PF-03882845 e di Trifluperidol si è abbassato in particolare, cadendo μM 4,79 al μM e 5,05, rispettivamente.

PF-03882845 e Inauhzin precedentemente sono stati nei test clinici come un agonista del ricevitore del mineralcorticoide ed inibitore di SIRT, rispettivamente, sebbene nessuno ancora fosse stato approvato per uso umano. Trifluperidol è un terapeutico conceduto una licenza a usato alle varie psicosi dell'ossequio ma è stato implicato con i vari effetti secondari nocivi nell'ambito di uso a lungo termine ed in modo da non può rendere un COVID-19 ideale profilattico. Comunque, queste droghe possono contribuire allo sviluppo di droghe più efficaci SARS-CoV-2.

Avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
  • Identification of SARS-CoV-2 Antiviral Compounds by Screening for Small Molecule Inhibitors of the nsp14 RNA Cap Methyltransferase, Souradeep Basu, Tiffany Mak, Rachel Ulferts, Mary Wu, Tom Deegan, Ryo Fujisawa, Kang Wei Tan, Chew Theng Lim, Clovis Basier, Berta Canal, Joseph F. Curran, Lucy Drury, Allison W. McClure, Emma L. Roberts, Florian Weissmann, Theresa U. Zeisner, Rupert Beale, Victoria H. Cowling, Michael Howell, Karim Labib, John F.X. Diffley, bioRxiv, 2021.04.07.438810; doi: https://doi.org/10.1101/2021.04.07.438810, https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.04.07.438810v1
Michael Greenwood

Written by

Michael Greenwood

Michael graduated from Manchester Metropolitan University with a B.Sc. in Chemistry in 2014, where he majored in organic, inorganic, physical and analytical chemistry. He is currently completing a Ph.D. on the design and production of gold nanoparticles able to act as multimodal anticancer agents, being both drug delivery platforms and radiation dose enhancers.

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