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Selecção para SARS-CoV-2 inibidores não-estruturais da proteína 14

O genoma do coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2) gera 16 proteínas não-estruturais distintas (nsp) que constituem as enzimas e as proteínas acessórias responsáveis para a réplica do vírus uma vez dentro de uma pilha de anfitrião. Estes complexos da proteína produzem e tampam as costas do RNA que irã0 sobre ser traduzidas pela maquinaria do anfitrião. Tampando o RNA de um modo que é reconhecido como similar ao mRNA endógeno assegura a compatibilidade, diminui a degradação do RNA avalia e abaixa a probabilidade de provocar uma resposta imune na pilha de anfitrião.

Em um papel transferido ficheiros pela rede recentemente ao bioRxiv* do server da pré-impressão por Diffley e outros (8 de abril de 2021th), os inibidores de uma proteína SARS-CoV-2 não-estrutural essencial são explorados, com os quatro compostos, em particular, identificados enquanto os chumbos potenciais do antiviral que exibem efeitos sinérgicos com remdesivir antiviroso da droga.

A função de nsp14

Depois da síntese da costa viral do RNA, nsp13 é envolvido em preparar a costa para tampar removendo o grupo terminal do fosfato, depois do qual nsp12 transfere a estrutura do tampão de GpppA ao 5' extremidade do RNA. Nsp14, nsp16, e nsp10 finalizam então a estrutura do tampão adicionando diversos grupos metílicos, formando Cap1.

O grupo demonstrou que o methylation executado pelo complexo nsp16/nsp10 é dependente do methylation prévio da costa por nsp14, e both of these enzimas exigem a presença da S-adenosyl-L-metionina (SAM), um fornecedor metílico, produzindo o S-adenosyl-L-homocysteine (SAH) em cima da doação. Nsp14 foi mostrado para ser um methyltransferase guanine-N7 que pudesse somente catalisar o methylation da estrutura começando de GpppA.

Nsp14 foi refinado e o grupo desenvolveu um ensaio para determinar quantifiably a conversão do SAM a SAH na presença da enzima e GppA-tampou o RNA, determinando desse modo a actividade da enzima do methyltransferase. Nsp14 foi seleccionado igualmente contra uma biblioteca sobre de 5.000 compostos químicos à procura dos chumbos antivirosos da droga, aplicada em uma concentração do μM 3,125, e cada um classificou baseado na eficácia. Os chumbos resultantes da droga foram refinados mais removendo os erros prováveis, os compostos que seriam difíceis à fonte, ou os aqueles da selecção com as toxicidades conhecidas na concentração exigida indicada.

Purificação nsp14 do esboço da guanina N7 Methyltransferase a) do genoma SARS-CoV-2. Pp1a e Pp1ab representam os polyproteins a e ab, respectivamente. Pp1a e pp1ab podem fender-se autoproteolytically para formar as proteínas do nsp esboçadas. O complexo viral de replicase/transcriptase produz uma série de RNAs viral aninhado que codifica proteínas virais (verdes) acessórias (alaranjado) ou estruturais. b) Esboço tampando do RNA viral. O nucleotide inicial do RNA possui um fosfato do γ e do β, ao contrário das seguintes bases do RNA. O fosfato do γ é removido por nsp13, seguido pela adição de Gp por nsp12, liberando o pirofosfato. nsp14 e nsp16/10 catalisam então a formação da estrutura Cap-0 final. c) Gel de Coomassie da segmentação de His14-SUMO. Coluna esquerda: A eluição do Ni-NTA perla sem o protease Ulp1 SUMO-dependente. Direito: A eluição do Ni-NTA perla após o tratamento com Ulp1 (veja métodos). d) Fracções da filtragem de gel de nsp14. Esquerda: Entrada à filtragem de gel. Direito: Fracções associadas do pico principal da eluição (mais baixa). tamanho previsto nsp14: kDa 55.
Purificação nsp14 do esboço da guanina N7 Methyltransferase a) do genoma SARS-CoV-2. Pp1a e Pp1ab representam os polyproteins a e ab, respectivamente. Pp1a e pp1ab podem fender-se autoproteolytically para formar as proteínas do nsp esboçadas. O complexo viral de replicase/transcriptase produz uma série de RNAs viral aninhado que codifica proteínas virais (verdes) acessórias (alaranjado) ou estruturais. b) Esboço tampando do RNA viral. O nucleotide inicial do RNA possui um fosfato do γ e do β, ao contrário das seguintes bases do RNA. O fosfato do γ é removido por nsp13, seguido pela adição de Gp por nsp12, liberando o pirofosfato. nsp14 e nsp16/10 catalisam então a formação da estrutura Cap-0 final. c) Gel de Coomassie da segmentação de His14-SUMO. Coluna esquerda: A eluição do Ni-NTA perla sem o protease Ulp1 SUMO-dependente. Direito: A eluição do Ni-NTA perla após o tratamento com Ulp1 (veja métodos). d) Fracções da filtragem de gel de nsp14. Esquerda: Entrada à filtragem de gel. Direito: Fracções associadas do pico principal da eluição (mais baixa). tamanho previsto nsp14: kDa 55.

Inibidores Nsp14

Um composto químico denominado PF-03882845 foi encontrado para ser o inibidor o mais poderoso, exibindo uma concentração inibitório 50% do μM 1,1. Trifluperidol, Inauhzin, e Lomeguatrib tiveram os valores IC50 o μM 12,9 do μM, 23, e o μM 59,8, respectivamente. A actividade destas drogas para o complexo nsp16/nsp10 foi testada igualmente, e nenhuns foram encontrados inibir o complexo, demonstrando a especificidade das drogas para nsp14.

As pilhas mamíferas foram contaminadas então com SARS-CoV-2, e os inibidores aplicados, seguido pela mancha fluorescente de anticorpos do anti-nucleoprotein, permitindo que o grupo siga a carga viral e a citotoxidade para as pilhas. PF-03882845, Inauhzin, e Trifluperidol valores cada IC50 tidos do μM no meio 11-13, por ordem da potência de diminuição, quando Lomeguatrib exigiu uma concentração do μM quase 60 para níveis similares da inibição. Nenhumas das drogas provaram ser citotóxicos na linha celular testada.

O remdesivir antiviroso da droga exige geralmente concentrações de ao redor 1 μM abaixar a carga viral nas pilhas testadas pelo grupo. Para testar a sinergia, a droga era aplicada em uma concentração de somente 0,5 μM em combinação com uma das quatro drogas do chumbo. Neste caso, Inauhzin exibiu os valores IC50 similares quando sozinho aplicado, quando as três outras drogas exibiram a sinergia significativa, tendo uns valores IC50 notàvel mais baixos. O IC50 de PF-03882845 e de Trifluperidol abaixou em particular, deixando cair o μM 4,79 ao μM e 5,05, respectivamente.

PF-03882845 e Inauhzin têm estado previamente nos ensaios clínicos como um agonista do receptor do mineralocorticoid e o inibidor de SIRT, respectivamente, embora nenhum foi aprovado ainda para o uso humano. Trifluperidol é um terapêutico licenciado usado às várias psicose do deleite mas foi implicado com vários efeitos secundários prejudiciais sob o uso a longo prazo, e assim que não pode fazer um COVID-19 ideal profiláctico. Em todo caso, estas drogas podem contribuir à revelação de umas drogas SARS-CoV-2 mais eficazes.

Observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
  • Identification of SARS-CoV-2 Antiviral Compounds by Screening for Small Molecule Inhibitors of the nsp14 RNA Cap Methyltransferase, Souradeep Basu, Tiffany Mak, Rachel Ulferts, Mary Wu, Tom Deegan, Ryo Fujisawa, Kang Wei Tan, Chew Theng Lim, Clovis Basier, Berta Canal, Joseph F. Curran, Lucy Drury, Allison W. McClure, Emma L. Roberts, Florian Weissmann, Theresa U. Zeisner, Rupert Beale, Victoria H. Cowling, Michael Howell, Karim Labib, John F.X. Diffley, bioRxiv, 2021.04.07.438810; doi: https://doi.org/10.1101/2021.04.07.438810, https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.04.07.438810v1
Michael Greenwood

Written by

Michael Greenwood

Michael graduated from Manchester Metropolitan University with a B.Sc. in Chemistry in 2014, where he majored in organic, inorganic, physical and analytical chemistry. He is currently completing a Ph.D. on the design and production of gold nanoparticles able to act as multimodal anticancer agents, being both drug delivery platforms and radiation dose enhancers.

Citations

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