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Investigación para SARS-CoV-2 los inhibidores no-estructurales de la proteína 14

El genoma del coronavirus 2 de la neumonía asiática (SARS-CoV-2) genera 16 proteínas no-estructurales distintas (nsp) que constituyan las enzimas y las proteínas accesorias responsables de la réplica del virus una vez dentro de una célula huesped. Estos complejos de la proteína producen y capsulan los cabos del ARN que continuarán ser traducidos por la maquinaria del ordenador principal. Capsulando el ARN de una forma se reconoce que como similar al mRNA endógeno asegura compatibilidad, aminora la degradación del ARN valora y baja la probabilidad de accionar una inmunorespuesta en la célula huesped.

En un papel cargado por teletratamiento recientemente al bioRxiv* del servidor de la prueba preliminar por Diffley y otros (8 de abril de 2021th), los inhibidores de una proteína no-estructural esencial SARS-CoV-2 se exploran, con cuatro composiciones, particularmente, determinadas como guías antivirus potenciales que exhiban efectos sinérgicos con el remdesivir antivirus de la droga.

La función de nsp14

Después de la síntesis del cabo viral del ARN, nsp13 es implicado en la preparación del cabo para capsular quitando el grupo terminal del fosfato, después de lo cual nsp12 transfiere la estructura del casquillo de GpppA al 5' extremo del ARN. Nsp14, nsp16, y nsp10 entonces concluyen la estructura del casquillo agregando a varios grupos metílicos, formando Cap1.

El grupo demostró que la metilación realizada por el complejo nsp16/nsp10 es relacionada sobre la metilación anterior del cabo por nsp14, y ambas enzimas requieren la presencia de la S-adenosyl-L-metionina (SAM), un dispensador de aceite metílico, produciendo la S-adenosyl-L-homocisteina (SAH) sobre la donación. Nsp14 fue mostrado para ser un methyltransferase guanine-N7 que puede catalizar solamente la metilación de la estructura de GpppA que comienza.

Nsp14 fue purificado y el grupo desarrolló un análisis quantifiably para determinar la conversión del SAM a SAH en presencia de la enzima y GppA-capsuló el ARN, de tal modo determinando la actividad de la enzima del methyltransferase. Nsp14 también fue revisado contra una biblioteca sobre de 5.000 composiciones químicas en busca de los guías antivirus de la droga, aplicada en una concentración del μM 3,125, y cada uno alineó basado en eficacia. Los guías resultantes de la droga fueron refinados más a fondo quitando los desvíos probables, las composiciones que serían difíciles a la fuente, o ésas de la investigación con toxicidades sabidas en la concentración requerida indicada.

Purificación nsp14 del contorno de la guanina N7 Methyltransferase a) del genoma SARS-CoV-2. Pp1a y Pp1ab representan los polyproteins a y ab, respectivamente. Pp1a y pp1ab pueden autoproteolytically henderse para formar las proteínas del nsp contorneadas. El complejo viral de replicase/transcriptase produce una serie de RNAs viral jerarquizado que codifica las proteínas virales (verdes) accesorias (anaranjado) o estructurales. b) Contorno que capsula del ARN viral. El nucleótido inicial del ARN posee un fosfato del γ y del β, a diferencia de bases siguientes del ARN. El fosfato del γ es quitado por nsp13, seguido por la adición del Gp por nsp12, liberando el pirofosfato. nsp14 y nsp16/10 entonces catalizan la formación de la estructura final Cap-0. c) Gel de Coomassie de la hendidura de His14-SUMO. Olumna izquierda: La elución del Ni-NTA rebordea sin la proteasa Sumo-relacionada Ulp1. La derecha: La elución del Ni-NTA rebordea después del tratamiento con Ulp1 (véase los métodos). d) Fracciones de la filtración de gel de nsp14. Izquierda: Entrada a la filtración de gel. La derecha: Fracciones reunidas del pico principal de la elución (más inferior). talla prevista nsp14: kDa 55.
Purificación nsp14 del contorno de la guanina N7 Methyltransferase a) del genoma SARS-CoV-2. Pp1a y Pp1ab representan los polyproteins a y ab, respectivamente. Pp1a y pp1ab pueden autoproteolytically henderse para formar las proteínas del nsp contorneadas. El complejo viral de replicase/transcriptase produce una serie de RNAs viral jerarquizado que codifica las proteínas virales (verdes) accesorias (anaranjado) o estructurales. b) Contorno que capsula del ARN viral. El nucleótido inicial del ARN posee un fosfato del γ y del β, a diferencia de bases siguientes del ARN. El fosfato del γ es quitado por nsp13, seguido por la adición del Gp por nsp12, liberando el pirofosfato. nsp14 y nsp16/10 entonces catalizan la formación de la estructura final Cap-0. c) Gel de Coomassie de la hendidura de His14-SUMO. Olumna izquierda: La elución del Ni-NTA rebordea sin la proteasa Sumo-relacionada Ulp1. La derecha: La elución del Ni-NTA rebordea después del tratamiento con Ulp1 (véase los métodos). d) Fracciones de la filtración de gel de nsp14. Izquierda: Entrada a la filtración de gel. La derecha: Fracciones reunidas del pico principal de la elución (más inferior). talla prevista nsp14: kDa 55.

Inhibidores Nsp14

Una composición química llamada PF-03882845 fue encontrada para ser el inhibidor más potente, exhibiendo una concentración inhibitoria el 50% del μM 1,1. Trifluperidol, Inauhzin, y Lomeguatrib tenían valores IC50 el μM 12,9 del μM, 23, y el μM 59,8, respectivamente. La actividad de estas drogas hacia el complejo nsp16/nsp10 también fue probada, y no se encontró ningunos inhibir el complejo, demostrando la especificidad de las drogas hacia nsp14.

Las células mamíferas entonces fueron infectadas con SARS-CoV-2, y los inhibidores aplicados, seguido por la coloración fluorescente de los anticuerpos de la anti-nucleoproteína, permitiendo que el grupo rastree la carga viral y la citotoxicidad hacia las células. PF-03882845, Inauhzin, y Trifluperidol valores tenidos cada IC50 del μM en medio 11-13, en orden de la potencia que aminora, mientras que Lomeguatrib requirió una concentración del μM casi 60 para los niveles similares de la inhibición. Ningunas de las drogas demostraron ser citotóxicas en la variedad de células probada.

El remdesivir antivirus de la droga requiere generalmente concentraciones de alrededor 1 μM bajar la carga viral en las células probadas por el grupo. Para probar sinergia, la droga era aplicada en una concentración de solamente 0,5 μM conjuntamente con una de las cuatro drogas del guía. En este caso, Inauhzin exhibió los valores similares IC50 cuando solo aplicado, mientras que las tres otras drogas exhibieron sinergia importante, teniendo valores notablemente más inferiores IC50. El IC50 de PF-03882845 y de Trifluperidol bajó particularmente, cayendo el μM 4,79 al μM y 5,05, respectivamente.

PF-03882845 e Inauhzin han estado previamente en juicios clínicas como un agonista del receptor del mineralocorticoide e inhibidor de SIRT, respectivamente, aunque ninguno todavía se ha aprobado para el uso humano. Trifluperidol es un terapéutico autorizado usado a las diversas psicosis de la invitación pero se ha implicado con diversos efectos secundarios perjudiciales bajo uso a largo plazo, y así que puede no hacer un COVID-19 ideal profiláctico. En todo caso, estas drogas pueden contribuir al revelado de drogas más efectivas SARS-CoV-2.

Advertencia *Important

el bioRxiv publica los partes científicos preliminares que par-no se revisan y, por lo tanto, no se deben mirar como concluyentes, conduce práctica clínica/comportamiento relativo a la salud, o tratado como información establecida.

Journal reference:
  • Identification of SARS-CoV-2 Antiviral Compounds by Screening for Small Molecule Inhibitors of the nsp14 RNA Cap Methyltransferase, Souradeep Basu, Tiffany Mak, Rachel Ulferts, Mary Wu, Tom Deegan, Ryo Fujisawa, Kang Wei Tan, Chew Theng Lim, Clovis Basier, Berta Canal, Joseph F. Curran, Lucy Drury, Allison W. McClure, Emma L. Roberts, Florian Weissmann, Theresa U. Zeisner, Rupert Beale, Victoria H. Cowling, Michael Howell, Karim Labib, John F.X. Diffley, bioRxiv, 2021.04.07.438810; doi: https://doi.org/10.1101/2021.04.07.438810, https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2021.04.07.438810v1
Michael Greenwood

Written by

Michael Greenwood

Michael graduated from Manchester Metropolitan University with a B.Sc. in Chemistry in 2014, where he majored in organic, inorganic, physical and analytical chemistry. He is currently completing a Ph.D. on the design and production of gold nanoparticles able to act as multimodal anticancer agents, being both drug delivery platforms and radiation dose enhancers.

Citations

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