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Inhibiteurs de petite molécule de SARS-CoV-2 recensé en examinant

Même pendant que le transfert vaccinique continue contre le coronavirus 2 (SARS-CoV-2) de syndrôme respiratoire aigu sévère, recherchant à porter une extrémité à la pandémie de la maladie 2019 de coronavirus (COVID-19), les variantes neuves apparaissent que des capacités immunisées d'évasion d'exposition. Les médicaments efficaces et sûrs restent ainsi essentiels pour traiter des infections sévères avec ce virus.

Un prétirage neuf, relâché sur le serveur de bioRxiv*, décrit l'identification des inhibiteurs de petite molécule qui bloquent l'activité catalytique de la protéine non-structurelle virale essentielle 5 (nsp5), suivre une méthode de dépistage de grande puissance.

L'importance de nsp5

Au moins neuf enzymes du virus sont importantes pour la prolifération virale et sont ainsi idéales pour le développement des antiviraux. Ces enzymes ont la même séquence entre les différents coronaviruses, à la différence de la pointe, du nucleocapsid et d'autres protéines de structure qui moins sont économisés. Ceci effectue des vaccins basés sur la dernière évasion immunisée plus encline de protéines par des mutations virales d'évasion.

L'ancien, d'autre part, pourrait permettre le développement d'un ou plusieurs demandes de règlement courantes de coronavirus (CoV), qui est tout importante que la pandémie SARS-CoV-2 est le coronavirus hautement pathogène de tiers pour heurter le monde.

La protéase principale nsp5 de SARS-CoV-2 est une enzyme liée à la chymotrypsine, et fend les grands polyproteins synthétisés par les deux cadres de lecture ouverts superposants (cadre ouvert de lecture 1a et cadre ouvert de lecture 1ab), à 11 sites différents. Le résultat de l'activité nsp5 est la production de nsp4 à nsp16.

Ces enzymes sont exigées pour installer le composé de transcription de réplication virale, où la réplication virale se produit après entrée virale dans la cellule. La structure et le fonctionnement de nsp5 est hautement économisée, avec la vulgarisation de 96% de la séquence entre Radars à ouverture synthétique-CoV et le virus actuel de diffusion.

Cette protéine virale a un site de clivage qui se produit après un résidu de glutamine, comme avec des la plupart des autres protéases de canalisation de CoV. Cette caractéristique est rare en protéases humaines, et indique qu'un médicament de carter-coronavirus peut être possible. La première étape est décrite dans cette étude, en employant un écran de médicament de haut-débit.

Quels sont les résultats ?

Les chercheurs ont employé un nsp5 intégral exprimé en système bactérien, à savoir, Escherichia coli. Un test de son rendement à un site de clivage a montré son affinité élevée, comme prévu.

Ils installent un transfert d'énergie personnalisé de résonance de Forster, une analyse basée sur frette, où des acides aminés d'un peptide 10 longtemps est employés pour vérifier l'activité enzymatique utilisant les signes fluorescents. La réaction suit un circuit rugueux linéaire à une concentration de 10 nanomètre, pour 20 premières mn de réaction à la température ambiante.

Le substrat pour l'enzyme était présent à une telle concentration pour assurent l'identification des inhibiteurs compétitifs et non-compétitifs, et du glycérol, ainsi que le détergent, a été ajouté pour stabiliser l'enzyme.

Une bibliothèque de médicament a été employée pour l'écran élevé de débit (HTS), contenant plus de 5.000 composés, utilisés aux concentrations de 4 μM et de 0,8 μM. Tous les composés que l'activité nps5 réduite de 30% à la concentration de 4 μM ont été prises pour être des coups primaires.

Les composés ont été incubés avec de l'enzyme avant que la réaction ait commencé de sorte que des inhibiteurs qui grippent lentement à l'enzyme ne soient pas exclus.

Ils ont également recensé des coups artificiels, étant ceux qui ont produit un régime de faux positif de la réaction en nuisant le signe fluorescent du HTS. des composés Automatique-fluorescents ont été exclus.

L'étude a recensé quatre inhibiteurs nsp5 spécifiques pendant la phase in vitro. Ils ont également constaté qu'un médicament appelé ebelsen, décrit comme inhibiteur nsp5 mais non recensé comme coup dans cet écran, seulement inhibé l'enzyme dans des conditions non-réductrices.

Résultats cellulaires d'analyse

Les premiers coups ont été alors vérifiés dans une analyse cellulaire pour que leur capacité empêche la réplication virale. Ils ont trouvé que l'inhibition la plus puissante s'est produite avec l'inhibiteur 1 de calpain, avec une concentration 50% efficace (EC50) de 0,28 μM. En revanche, des des autres heurtés, l'inhibiteur de Z-VAD-FMK, montré l'activité seulement aux niveaux plus de μM 100.

Quand des combinaisons des inhibiteurs ont été vérifiées, elles ont constaté qu'aucun de ces inhibiteurs n'a augmenté l'efficacité du remdesivir, un inhibiteur ARN-dépendant de polymérase ARN utilisé généralement en traitant l'infection SARS-CoV-2.

Inhibiteurs peptidomimetic de FMK

Les inhibiteurs peptidomimetic de FMK (groupe de fluoromethylketone) se sont avérés pour avoir le pouvoir inhibiteur in vitro le plus grand. Ils tous ont une pièce qui améliore la perméabilité à cellules, une séquence de désignation d'objectifs peptidyle courte, et un groupe fonctionnel qui subit le grippement covalent à et inactive le résidu actif de cystéine en protéases.

Ils ont constaté que dans tous les inhibiteurs peptidomimetic, le groupe de FMK est le groupe fonctionnel. Ceux-ci ne montrent aucun signe de toxicité de cellules in vitro mais in vivo, ils sont métabolisés au fluoroacetate, un composé de toxique.

Utilisant des solutions de rechange plus sûres, telles que les inhibiteurs basés sur le groupe fonctionnel de difluorophenoxymethyl-cétone (OPh), qui sont disponibles dans le commerce, ils ont trouvé cet un de ces derniers, à savoir, Q-IETD-OPh, étaient l'inhibiteur le plus puissant, avec une concentration 50% inhibitrice (IC50) du μM 17,4.

Bien que ceux-ci n'aient pas été dans la bibliothèque originelle, ces peptides ressemblent attentivement aux premiers coups primaires, différant seulement par le groupe fonctionnel. Pourtant ils sont les inhibiteurs moins puissants de l'enzyme in vitro comparée aux inhibiteurs de FMK.

Puisqu'on le sait que les grands résidus hydrophobes jouent un rôle en identifiant des substrats, ils ont changé la séquence du groupe fonctionnel peptidyle pour augmenter l'effet inhibiteur sur nsp5. Ces trois inhibiteurs personnalisés de FMK ont eu 4-6 acides aminés dans ce segment, comparé à 3-4 dans les molécules originelles.

Le groupe peptidyle ici a ressemblé à la séquence naturelle au site du clivage nsp4/5, mais avec le remplacement d'un acide aspartique et d'une alanine pour une glutamine et une thréonine aux sites P1 et P6.

Le résultat était nettement les valeurs IC50 améliorées, s'échelonnant de 0,02 à 0,8 nanomètres pour le peptide le plus court des trois. Le composé avec l'IC50 le plus inférieur, Z-AVLD-FMK, est ainsi beaucoup plus inhibiteur que le meilleur composé commercial procurable, Z-VAD-FMK, avec un IC50 de 0,16 μM.

Répétant le test in vivo, ils ont trouvé la concentration 50% efficace (EC50) pour être le μM 66, indiquant le double le pouvoir comparé au premier inhibiteur commercial. « Ceci a montré que cela le changement de la partie peptidyle pour imiter le substrat nsp5 a grand amélioré son effet inhibiteur in vitro et cellulaire. »

Implications et orientations futures

L'inhibiteur 1 de calpain s'est avéré sûr chez les souris, avec l'inhibition de l'accroissement viral d'une analyse cellulaire. C'est pour cette raison un bon candidat pour le développement antiviral dans la pandémie de courant.

Deuxièmement, les peptides cellule-perméables de FMK peuvent être employés pour empêcher les protéases spécifiques en modifiant leurs séquences peptidyles pour être identiques à la séquence du substrat protéase-grippant - dans ce cas, la séquence préférée par nsp5-binding.

« Le plus court des inhibiteurs faits sur commande, Z-AVLD-FMK, a montré le pouvoir extraordinaire d'inhibiteur in vitro avec un sous-nanomolar IC50. » Le pouvoir était encore plus élevé dans l'analyse cellulaire, prouvant que des inhibiteurs peptidomimetic peuvent être facilement adaptés pour explorer l'activité de cette enzyme, in vitro et dans la culture cellulaire.

Le développement ultérieur a pu comprendre comporter la glutamine courante aux sites de clivage, aux sites P1, ou à employer le groupe d'OPh après la personnalisation adaptée de la séquence de substrat, au lieu de la partie de FMK avec ses métabolites toxiques.

Avis *Important

le bioRxiv publie les états scientifiques préliminaires qui pair-ne sont pas observés et ne devraient pas, en conséquence, être considérés comme concluants, guident la pratique clinique/comportement relatif à la santé, ou traité en tant qu'information déterminée.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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