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Piccoli inibitori della molecola di SARS-CoV-2 identificato schermando

Proprio mentre lo srotolamento vaccino continua contro il coronavirus 2 (SARS-CoV-2) di sindrome respiratorio acuto severo, cercante di portare un'estremità alla pandemia di malattia 2019 di coronavirus (COVID-19), le nuove varianti emergono che le capacità immuni di fuga di manifestazione. Le efficaci e droghe sicure rimangono così essenziali per trattare le infezioni severe con questo virus.

Una nuova pubblicazione preliminare, rilasciata sul " server " del bioRxiv*, descrive l'identificazione di piccoli inibitori della molecola che bloccano l'attività catalitica della proteina non strutturale virale cruciale 5 (nsp5), facendo uso di un metodo di vagliatura su grande scala.

L'importanza di nsp5

Almeno nove enzimi del virus sono importanti per proliferazione virale e sono così ideali per lo sviluppo delle droghe antivirali. Questi enzimi hanno la stessa sequenza fra i coronaviruses differenti, a differenza della punta, del nucleocapsid e di altre proteine strutturali che più di meno sono conservati. Ciò fa i vaccini basati all'sull'evasione immune più incline posteriore delle proteine dalle mutazioni virali di fuga.

Il precedente, d'altra parte, potrebbe permettere lo sviluppo di uno o più trattamenti comuni di coronavirus (CoV), che è per quanto la pandemia SARS-CoV-2 fosse importante il coronavirus altamente patogeno di terzo per colpire il mondo.

La proteasi principale nsp5 di SARS-CoV-2 è un enzima relativo a chimotripsina e fende i grandi poliproteici sintetizzati dai due fotogrammi di lettura aperti di sovrapposizione (ORF 1a ed ORF 1ab), a 11 sito differente. Il risultato di attività nsp5 è la produzione di nsp4 a nsp16.

Questi enzimi sono richiesti di installare il complesso della trascrizione della replicazione virale, in cui la replicazione virale si presenta dopo l'entrata virale nella cella. La struttura e la funzione di nsp5 altamente è conservata corrente, con comunanza di 96% della sequenza fra SAR-CoV ed il virus circolante.

Questa proteina virale ha un sito di fenditura che si presenta dopo un residuo della glutamina, come con la maggior parte delle altre proteasi del main di CoV. Questa funzionalità è rara in proteasi umane ed indica che una droga pan--coronavirus può essere possibile. Il primo punto è descritto in questo studio, mediante l'uso di uno schermo della droga di alto-capacità di lavorazione.

Che cosa sono i risultati?

I ricercatori hanno usato un nsp5 integrale espresso in un sistema batterico, vale a dire, Escherichia coli. Un esame del suo risparmio di temi ad un sito di fenditura ha provato la sua alta affinità, come previsto.

Installano un trasferimento di energia su misura di risonanza di Forster, ad un'analisi basata a cerchio, dove gli amminoacidi di un peptide 10 lungamente è usato per verificare l'attività enzimatica facendo uso dei segnali fluorescenti. La reazione segue un percorso approssimativamente lineare ad una concentrazione di 10 nanometro, per i primi 20 minuti della reazione alla temperatura ambiente.

Il substrato per l'enzima era presente ad una tal concentrazione quanto a assicura l'identificazione sia degli inibitori non Xerox che non non Xerox e del glicerolo come pure il detersivo, si è aggiunto per stabilizzare l'enzima.

Una libreria della droga è stata usata per l'alto schermo di capacità di lavorazione (HTS), contenendo oltre 5.000 composti, usati alle concentrazioni di 4 μM e di 0,8 μM. Tutti i composti che hanno ridotto l'attività nps5 di 30% alla concentrazione di 4 μM sono stati catturati per essere colpi primari.

I composti sono stati incubati con l'enzima prima che la reazione cominciasse in modo che gli inibitori che legano lentamente all'enzima non si escludessero.

Egualmente hanno identificato i colpi artificiali, essendo quelli che hanno prodotto una tariffa del falso positivo della reazione interferendo con il segnale fluorescente della NTA. i composti Automatico-fluorescenti si sono esclusi.

Lo studio ha identificato quattro inibitori specifici nsp5 durante la fase in vitro. Egualmente hanno trovato che una droga chiamata ebelsen, descritto come inibitore nsp5 ma non identificato come colpo in questo schermo, solo inibito l'enzima nelle circostanze non riducenti.

a risultati basati a cella di analisi

I colpi superiori poi sono stati provati ad un'in un'analisi basata a cella a loro capacità di inibire la replicazione virale. Hanno trovato che l'inibizione più potente si è presentata con l'inibitore 1 di Calpain, con una concentrazione efficace 50% (EC50) di 0,28 μM. Al contrario, un altro colpiti, l'inibitore di Z-VAD-FMK, indicato attività soltanto ai livelli oltre μM 100.

Quando le combinazioni di inibitori sono state provate, hanno trovato che nessuno di questi inibitori hanno aumentato l'efficacia di remdesivir, un inibitore RNA-dipendente del RNA polimerasi comunemente usato nel trattamento dell'infezione SARS-CoV-2.

Inibitori peptidomimetic di FMK

Gli inibitori peptidomimetic di FMK (gruppo di fluoromethylketone) sono stati trovati per avere la più grande potenza inibitoria in vitro. Tutti hanno una parte che migliora la permeabilità delle cellule, una breve sequenza d'ottimizzazione peptidilica e un gruppo funzionale che subisce il legame covalente a ed inattiva il residuo attivo della cisteina in proteasi.

Hanno trovato che in tutti gli inibitori peptidomimetic, il gruppo di FMK è il gruppo funzionale. Questi non mostrano alcuni segni della tossicità delle cellule in vitro ma in vivo, sono metabolizzate a fluoroacetate, un composto tossico.

Facendo uso delle alternative più sicure, quali gli inibitori basati sul gruppo funzionale del difluorophenoxymethyl-chetone (OPh), che sono disponibili nel commercio, hanno trovato quell'uno di questi, vale a dire, Q-IETD-OPh, erano l'inibitore più potente, con una concentrazione inibitoria 50% (IC50) di μM 17,4.

Sebbene questi non siano nella libreria originale, questi peptidi somigliano molto attentamente ai colpi primari superiori, differenti soltanto dal gruppo funzionale. Eppure sono inibitori meno potenti dell'enzima in vitro confrontato agli inibitori di FMK.

Poiché è conosciuto che i grandi residui idrofobi svolgono un ruolo nel riconoscimento dei substrati, hanno cambiato la sequenza del gruppo funzionale peptidilico per aumentare l'effetto inibitorio su nsp5. Questi tre hanno personalizzato gli inibitori di FMK hanno avuti 4-6 amminoacidi in questo segmento, confrontato a 3-4 nelle molecole originali.

Il gruppo peptidilico qui ha somigliato alla sequenza naturale al sito di fenditura nsp4/5, ma con la sostituzione di un acido aspartico e di un'alanina per una glutamina e una teonina ai siti P1 e P6.

Il risultato era contrassegnato i valori migliori IC50, varianti da 0,02 a 0,8 nanometri per il più breve peptide dei tre. Il composto con il IC50 più basso, Z-AVLD-FMK, è così molto più inibitorio di migliore composto commerciale disponibile, Z-VAD-FMK, con un IC50 di 0,16 μM.

Ripetendo la prova in vivo, hanno trovato la concentrazione efficace 50% (EC50) per essere μM 66, indicante il doppio la potenza confrontata all'inibitore commerciale superiore. “Questo ha mostrato che quello cambiare la parte peptidilica per imitare il substrato nsp5 notevolmente ha migliorato il suo al effetto inibitorio in vitro e basato a cella.

Implicazioni ed orientamenti futuri

L'inibitore 1 di Calpain è stato indicato per essere sicuro in mouse, con inibizione di crescita virale ad un'in un'analisi basata a cella. È quindi un buon candidato per lo sviluppo antivirale nella pandemia corrente.

Secondariamente, i peptidi cella-permeabili di FMK possono essere usati per inibire le proteasi specifiche alterando le loro sequenze peptidiliche per essere identici alla sequenza del substrato dell'proteasi-associazione - in questo caso, la sequenza preferita nsp5-binding.

“Il più breve degli inibitori su ordinazione, Z-AVLD-FMK, ha mostrato la potenza straordinaria dell'inibitore in vitro con un IC50 sotto--nanomolar.„ La potenza era ancora più alta all'nell'analisi basata a cella, indicante che gli inibitori peptidomimetic possono adattarsi facilmente per esplorare l'attività di questo enzima, sia in vitro che nella coltura cellulare.

Ulteriore sviluppo ha potuto comprendere l'incorporazione della glutamina comune ai siti di fenditura, ai siti P1, o a usando il gruppo di OPh dopo personalizzazione adatta della sequenza del substrato, invece della parte di FMK con i sui metaboliti tossici.

Avviso *Important

il bioRxiv pubblica i rapporti scientifici preliminari che pari-non sono esaminati e, pertanto, non dovrebbero essere considerati conclusivi, guida la pratica clinica/comportamento correlato con la salute, o trattato come informazioni stabilite.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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