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Inibidores pequenos da molécula de SARS-CoV-2 identificado selecionando

Mesmo enquanto o desenrolamento vacinal continua contra o coronavirus 2 da Síndrome Respiratória Aguda Grave (SARS-CoV-2), procurando trazer uma extremidade à doença 2019 do coronavirus (COVID-19) pandémica, as variações novas emergem que capacidades imunes do escape da mostra. As drogas eficazes e seguras permanecem assim essenciais tratar infecções severas com este vírus.

Uma pré-impressão nova, liberada no server do bioRxiv*, descreve a identificação dos inibidores pequenos da molécula que obstruem a actividade catalítica da proteína não-estrutural viral crucial 5 (nsp5), usando um método de selecção em grande escala.

A importância de nsp5

Pelo menos nove enzimas do vírus são importantes para a proliferação viral e são assim ideais para a revelação de drogas antivirosas. Estas enzimas têm a mesma seqüência entre os coronaviruses diferentes, ao contrário do ponto, do nucleocapsid e de outras proteínas estruturais que são conservados menos. Isto faz as vacinas baseadas na última evasão imune mais inclinada das proteínas por mutações virais do escape.

O anterior, por outro lado, poderia permitir a revelação de uns ou vários tratamentos comuns do coronavirus (CoV), que é por mais importante que a pandemia SARS-CoV-2 fosse o coronavirus altamente patogénico do terço para bater o mundo.

O protease principal nsp5 de SARS-CoV-2 é uma enzima relativa à quimotripsina, e fende os grandes polyproteins sintetizados pelos dois quadros de leitura abertos de sobreposição (ORF 1a e ORF 1ab), em 11 locais diferentes. O resultado da actividade nsp5 é a produção de nsp4 a nsp16.

Estas enzimas são exigidas para estabelecer o complexo viral da transcrição da réplica, onde a réplica viral ocorre depois da entrada viral na pilha. A estrutura e a função de nsp5 são conservadas altamente, com normalização de 96% da seqüência entre SARS-CoV e o vírus actualmente de circulação.

Esta proteína viral tem um local da segmentação que ocorra após um resíduo da glutamina, como com a maioria outros de proteases do cano principal de CoV. Esta característica é rara em proteases humanos, e indica que uma droga da bandeja-coronavirus pode ser possível. A primeira etapa é descrita neste estudo, pelo uso de uma tela da droga da alto-produção.

Que são os resultados?

Os pesquisadores usaram um nsp5 completo expressado em um sistema bacteriano, a saber, Escherichia Coli. Um teste de sua eficiência em um local da segmentação mostrou sua afinidade alta, como esperado.

Estabelecem transferência de energia personalizada da ressonância de Forster, um ensaio Fricção-baseado, onde os ácidos aminados de um peptide 10 são usados por muito tempo para testar a actividade enzimático usando sinais fluorescentes. A reacção segue um trajecto aproximadamente linear em uma concentração de 10 nanômetro, para os primeiros 20 minutos da reacção na temperatura ambiente.

A carcaça para a enzima estou presente em tal concentração a respeito de assegura a identificação de inibidores competitivos e não-competitivos, e de glicerol, assim como o detergente, foi adicionado para estabilizar a enzima.

Uma biblioteca da droga foi usada para a tela alta da produção (HTS), contendo sobre 5.000 compostos, usados em concentrações de 4 μM e de 0,8 μM. Todos os compostos que reduziram a actividade nps5 por 30% na concentração de 4 μM foram tomados para ser batidas preliminares.

Os compostos foram incubados com a enzima antes que a reacção começou de modo que os inibidores que ligam lentamente à enzima não fossem excluídos.

Igualmente identificaram batidas artificiais, sendo aqueles que produziram uma taxa do falso positivo de reacção interferindo com o sinal fluorescente do HTS. os compostos Auto-fluorescentes foram excluídos.

O estudo identificou quatro inibidores nsp5 específicos durante in vitro a fase. Igualmente encontraram que uma droga chamada ebelsen, descrito como um inibidor nsp5 mas não identificado como uma batida nesta tela, simplesmente inibido a enzima sob a não-diminuição condiciona.

Resultados baseados em celulas do ensaio

As batidas superiores foram testadas então em um ensaio baseado em celulas para que sua capacidade iniba a réplica viral. Encontraram que a inibição a mais poderosa ocorreu com inibidor 1 de Calpain, com uma concentração 50% eficaz (EC50) de 0,28 μM. Ao contrário, outros batidos, o inibidor de Z-VAD-FMK, mostrado a actividade somente a níveis sobre o μM 100.

Quando as combinações de inibidores foram testadas, encontraram que nenhuns destes inibidores aumentaram a eficácia do remdesivir, um inibidor RNA-dependente da polimerase de RNA de uso geral em tratar a infecção SARS-CoV-2.

Inibidores peptidomimetic de FMK

Os inibidores peptidomimetic de FMK (grupo do fluoromethylketone) foram encontrados para ter a grande in vitro potência inibitório. Todos têm uma peça que aumente a permeabilidade da pilha, uma seqüência de escolha de objectivos peptidyl curto, e um grupo funcional que se submeta ao emperramento covalent a e se neutralize o resíduo activo do cysteine nos proteases.

Encontraram que em todos os inibidores peptidomimetic, o grupo de FMK é o grupo funcional. Estes não mostram nenhuns sinais da toxicidade da pilha in vitro mas in vivo, são metabolizadas ao fluoroacetate, um composto tóxico.

Usando umas alternativas mais seguras, tais como os inibidores baseados no grupo funcional da difluorophenoxymethyl-cetona (OPh), que são disponíveis no comércio, encontrou esse um destes, a saber, Q-IETD-OPh, era o inibidor o mais poderoso, com uma concentração 50% inibitório (IC50) do μM 17,4.

Embora estes não estavam na biblioteca original, estes peptides assemelham-se pròxima às batidas preliminares superiores, diferindo somente pelo grupo funcional. Contudo são inibidores menos poderosos da enzima in vitro comparada aos inibidores de FMK.

Desde que se sabe que os grandes resíduos hidrofóbicas jogam um papel em reconhecer carcaças, mudaram a seqüência do grupo funcional peptidyl para aumentar o efeito inibitório em nsp5. Estes três personalizaram inibidores de FMK tiveram 4-6 ácidos aminados neste segmento, comparado a 3-4 nas moléculas originais.

O grupo peptidyl aqui assemelhou-se à seqüência natural no local da segmentação nsp4/5, mas com a substituição de um ácido aspartic e de uma alanina para uma glutamina e uma treonina nos locais P1 e P6.

O resultado era marcada os valores IC50 melhorados, variando de 0,02 a 0,8 nanômetros para o peptide o mais curto dos três. O composto com o mais baixo IC50, Z-AVLD-FMK, é assim muito mais inibitório do que o melhor composto comercial disponível, Z-VAD-FMK, com um IC50 de 0,16 μM.

Repetindo o teste in vivo, encontraram a concentração 50% eficaz (EC50) para ser o μM 66, indicando o dobro a potência comparada ao inibidor comercial superior. “Isto mostrou que isso mudar a parte peptidyl para imitar a carcaça nsp5 melhorou extremamente o seu in vitro e o efeito inibitório baseado em celulas.

Implicações e sentidos futuros

O inibidor 1 de Calpain foi mostrado para ser seguro nos ratos, com inibição de crescimento viral em um ensaio baseado em celulas. É conseqüentemente um bom candidato para a revelação antivirosa na pandemia actual.

Em segundo lugar, os peptides pilha-permeáveis de FMK podem ser usados para inibir proteases específicos alterando suas seqüências peptidyl para ser idênticos à seqüência da carcaça protease-obrigatória - neste caso, a seqüência preferida nsp5-binding.

“O mais curto dos inibidores feitos sob encomenda, Z-AVLD-FMK, mostrou a potência extraordinária do inibidor in vitro com um IC50 secundário-nanomolar.” A potência era ainda mais alta no ensaio baseado em celulas, mostrando que os inibidores peptidomimetic podem facilmente ser adaptados para explorar in vitro a actividade desta enzima, e na cultura celular.

Uma revelação mais adicional podia incluir a incorporação da glutamina comum nos locais da segmentação, nos locais P1, ou em usar o grupo de OPh após a personalização apropriada da seqüência da carcaça, em vez da parte de FMK com seus metabolitos tóxicos.

Observação *Important

o bioRxiv publica os relatórios científicos preliminares que par-não são revistos e, não devem conseqüentemente ser considerados como conclusivos, guia a prática clínica/comportamento saúde-relacionado, ou tratado como a informação estabelecida.

Journal reference:
Dr. Liji Thomas

Written by

Dr. Liji Thomas

Dr. Liji Thomas is an OB-GYN, who graduated from the Government Medical College, University of Calicut, Kerala, in 2001. Liji practiced as a full-time consultant in obstetrics/gynecology in a private hospital for a few years following her graduation. She has counseled hundreds of patients facing issues from pregnancy-related problems and infertility, and has been in charge of over 2,000 deliveries, striving always to achieve a normal delivery rather than operative.

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